WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

15.30

11.62

Сахароза

8.62

-

Адаптация солелюбивых бактерий H. halobium к тяжёлой воде. В случае с H. halobium адаптацию проводили как на агаре, содержащим 99.9% тяжёлую воду с добавлением гидролизатов (2Н)меченой биомассы B. methylicum, путём рассева штамма до отдельных колоний, так и на жидкой ГС 2 среде. В обычных для этой культуры условиях культивирования (37 0С, на свету) в клетках синтезировался фиолетовый пигмент по всем характеристикам не отличающийся от нативного белка бактериородопсина.

Проведённые нами исследования свидетельствуют, что способность к адаптации к тяжёлой воде у разных родов и видов бактерий различная и может варьировать на примере метилотрофных бактерий в пределах даже одной таксономической группы. Из этого можно заключить, что адаптация к тяжёлой воде определяется как таксономической специфичностью микрооорганизмов, так и особенностями их метаболизма, функционированием различных путей ассимиляции субстратов, а также эволюционной нисшей, которую занимает исследуемый объект. При этом чем ниже уровень эволюционного развития организма, тем лучше он приспосабливается к присутствию дейтерия в среде. Так, из изученных объектов самыми примитивными в эволюционном плане являются галофильные бактерии, относящиеся к археобактериям, практически не нуждающие в адаптации к тяжёлой воде, чего нельзя сказать о метилотрофных бактериях, которые труднее адаптируются к тяжёлой воде. Для всех изученных микроорганизмов рост на тяжёлой воде сопровождался снижением ростовых характеристик а также уровня продукции секретируемых БАС.

Полученные для изученных микроорганизмов данные в целом подтверждают устойчивое представление о том, что адаптация к тяжёлой воде является фенотипическим явлением, поскольку адаптированные к тяжелой воде клетки возвращаются к нормальному росту и биосинтезу в протонированных средах после некоторого лаг-периода. По-видимому, метаболизм адаптированных клеток не претерпевает существенных изменений в тяжёлой воде. В то же время эффект обратимости роста на водно/тяжёловодородных средах теоретически не исключает возможности того, что этот признак стабильно сохраняется при росте в воде, но маскируется при переносе клеток на тяжёлую воду. Однако, здесь необходимо подчеркнуть, что для проведения адаптации играет немаловажную роль состав среды культивирования. При этом не исключено, что при проведении адаптации на минимальных средах, содержащих тяжёлую воду образуются формы бактерий, ауксотрофные по определенным ростовым факторам, например аминокислотам, и вследствие этого бактериальный рост ингибируется. Адаптация к тяжёлой воде происходит лучше всего именно на комплексных средах, содержащих широкий набор ростовых факторов и аминокислот, компенсирующих потребность бактерий в этих соединениях.

Можно предположить, что клетка реализует лабильные адаптивные механизмы, которые способствуют функциональной реорганизации работы жизненно-важных систем в тяжёлой воде. Так, например, нормальному биосинтезу и функционированию в тяжёлой воде таких биологически активных соединений, как нуклеиновые кислоты и белки способствует поддержание их структуры посредством формирования водородных (дейтериевых) связей в молекулах. Связи, сформированные атомами дейтерия различаются по прочности и энергии от аналогичных водородных связей. Различия в нуклеарной массе атома водорода и дейтерия косвенно могут служить причиной различий в синтезах нуклеиновых кислот, которые могут приводить в свою очередь к структурным различиям и, следовательно, к функциональным изменениям в клетке. Вероятнее всего, что ферментативные функции и структура синтезируемых белков также изменяются при росте клеток на тяжёлой воде, что может отразиться на процессах метаболизма и деления клетки. Некоторые исследователи сообщают, что после обратного изотопного (1Н-2H)-обмена ферменты не прекращают своей функции, но изменения в результате изотопного замещения за счет первичного и вторичного изотопных эффектов, а также действие тяжёлой воды как растворителя (большая структурированность и вязкость по сравнению с обычной водой) приводили к изменению скоростей и специфичности ферментативных реакций в тяжёлой воде [14-15].

Структурно-динамические свойства клеточной мембраны, которые в большинстве зависят от качественного и количественного состава липидов, также могут изменяться в присутствии тяжёлой воды. Так, сравнительный анализ липидного состава дейтерированных клеток B. subtilis, полученных при росте на тяжёлой воде показал различия в количественном составе мембранных липидов по сравнению с обычной водой (рис. 4). Примечательно, что в образце полученном с тяжёлой воды соединения, имеющие времена удерживания - 33.38; 33.74 и 33.2 мин не детектируются (рис. 4 б). Полученный результат, по видимому, объясняется тем, что клеточная мембрана является одной из первых органелл клетки, которая испытывает воздействие тяжёлой воды, и тем самым компенсирует реалогические параметры мембраны (вязкость, текучесть, структурированность) изменением количественного состава липидов.

Рис.4. Липидные профили бактерий B. subtilis, полученные на обычной (а) и тяжёлой воде (б): Анализ проводили на хроматографе Beckman Gold Systems (США); сорбент: Ultrasphere ODS 5 мкм; 4.6x250 мм; элюент: линейный градиент 5 мМ бисульфат калия-ацетонитрил; 100 об.% в течении 50 мин; скорость элюции: 0.5 мл/мин; детекция при длине волны 210 нм.

В общих чертах, при попадании клетки в дейтерированную среду из неё не только исчезает протонированная вода за счет реакции обмена вода-тяжёлая вода, но и происходит очень быстрый изотопный (1Н-2H)-обмен в гидроксильных, карбоксильных, сульфгидрильных и аминогруппах всех органических соединений, включая нуклеиновые кислоты, липиды, белки и сахара. Известно, что в этих условиях только С-Н связь не подвергается изотопному обмену и вследствие этого только соединения со связями типа С-2H могут синтезироваться de novo [16].

Кроме вышеобозначенных эффектов, возможное изменение соотношения основных метаболитов в процессе адаптации к тяжелой воде также может негативно сказываться на рост клетки.

Также не исключено, что эффекты, наблюдаемые при адаптации к тяжёлой воде связаны с образованием в тяжёлой воде конформаций молекул с иными структурно-динамическими свойствами, чем конформаций, образованных с участием водорода, и поэтому имеющих другую активность и биологические свойства. Так, по теории абсолютных скоростей разрыв С2H-связей может происходить быстрее, чем СH-связей, подвижность иона 2H+ меньше, чем подвижность Н+, константа ионизации тяжёлой воды несколько меньше константы ионизации обычной воды [17].

Суммируя полученные данные, можно сделать вывод, что чувствительности различных клеточных систем к тяжёлой воде отличны. С точки зрения физиологии, наиболее чувствительными к замене Н+ на 2H+ могут оказаться аппарат биосинтеза макромолекул и дыхательная цепь, т. е., именно те клеточные системы, которые используют высокую подвижность протонов и высокую скорость разрыва водородных связей.

Нам представляется выбор бактерий в качестве модельных объектов для данных исследований наиболее целесообразным, так как прокариоты как организмы, стоящие на более низких ступенях развития живого, наиболее лабильны в генетическом аспекте и тем самым быстрее реагируют и приспосабливаются к изменчивым факторам среды. В заключение следует подчеркнуть, что для того чтобы сделать более конкретные выводы о природе и механизме адаптации клеток к тяжелой воде, необходимы новые экспериментальные данные по физиологии и биохимии адаптированных клеток.

Материалы и методы:

Объектами исследования служили генетически маркированные штаммы-продуценты аминокислот, белков и нуклеозидов, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов:

1. Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, лейцинзависимый штамм факультативных метилотрофных бактерий, продуцент фенилаланина.

2. Methylobacillus flagellatum КТ, изолейцинзависимый штамм облигатных метилотрофных бактерий, продуцент лейцина.

3. Bacillus subtilis В-3157, полиауксотрофный по гистидину, тирозину, аденину и урацилу штамм грамотрицательных бактерий, продуцент инозина.

4. Halobacterium halobium ЕТ 1001, пигментсодержащий штамм галофильных бактерий, способный синтезировать бактериородопсин.

Для приготовления сред и адаптации бактерий использовали тяжёлую воду (99.9% 2H), и дейтерохлористую кислоту (95.5% 2H) и [U- 2Н]метанол (97.5% 2H), полученные из Российского научно-исследовательского центра “Изотоп” (Санкт-Петербург, РФ). По необходимости тяжёлую воду очищали от вредных примесей, перегоняя её над перманганатом калия [18].

Стартовым материалом для культивирования галофильных бактерий и бацилл служила (2Н)меченая биомасса метилотрофных бактерий, полученная в условиях многостадийной адаптации на твердых агаризованных средах (2% агар) с 2% [U- 2Н]метанолом, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды (от 0 до 98% тяжёлой воды). Полученную таким образом (2Н)меченую биомассу B. methylicum (выход составил 100 г по влажному весу с 1 л. среды) автоклавировали в 0.5 н. растворе дейтерохлорной кислоты (в тяжёлой воде) (08 ати, 30 мин), нейтрализовали 0.1 н. КОН (рН 7.0) и использовали далее в качестве источника ростовых факторов для адаптации и культивирования бацилл и галофильных бактерий.

При культивировании клеток микроорганизмов использовали следующие питательные среды (количества компонентов приведены в г/л):

1. Минимальная среда М9, на основе различных концентраций тяжёлой воды (см. табл. 1 и табл. 2) и добавками 0.5-2% метанола (в зависимости от физиологической потребности бактерий) или [U-2H]метанола: KH2PO4 3; Na2HPO4 6; NaCl 0.5; NH4Cl 1. Среду использовали для культивирования метилотрофных бактерий.

2. Гидролизная среда 1 (ГС1) для культивирования бацилл (на основе 99.9% тяжёлой воды): глюкоза 120; (2Н)меченая биомасса B. methylicum 25; NH4NO3 30; MgSO4 x 7H2O 20; мел 20.

3. Гидролизная среда 2 (ГС2) для культивирования галофильных бактерий (на основе 99.9% тяжёлой воды): NaCl 250; MgSO4 x 7H2O 20; KCl 2; CaCl2 x 6H2O 0.065; цитрат натрия 0.5; (2Н)меченая биомасса B. methylicum 20.

Культивирование метилотрофных бактерий и бацилл проводили при 370 С в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл с наполнением средой до 50 мл в условиях интенсивной аэрации по методикам [5-8], используя в качестве источников дейтерия тяжёлую воду и [U-2H]метанол. В случае с галофильными бактериями их культивирование проводили на тяжеловодородной среде при освещении лампами дневного света ЛБ-40. После 6-7 суток культивирования клетки отделяли центрифугированием (10000 об/мин, 20 мин). В культуральных жидкостях анализировали секретируемые аминокислоты и нуклеозиды.

Для выделения фракции суммарных белков биомассы клетки дважды промывали дистиллированной водой с последующим центрифугированием (10000 об/мин, 20 мин), экспонировали ультразвуком при 22 кГц (3 x 15 мин) и центрифугировали. Липиды и пигменты экстрагировали смесью органических растворителей хлороформ-метанол-ацетон (2:1:1) по методу Блайя и Дайера [19]. Полученный осадок высушивали до постоянного веса (10-12 мг) и использовали его в качестве фракции суммарных белков биомассы.

Суммарные белки биомассы гидролизовали в запаянных стеклянных ампулах в 50-ти кратном избытке 6 н. дейтерохлористой кислоты (в тяжёлой воде). Ампулы выдерживали при 1100 в течение 24 ч. После этого реакционную массу суспендировали в горячей дистиллированной воде, фильтровали. Гидролизат упаривали в роторном испарителе при 400 С. Остатки дейтеросоляной кислоты удаляли путем выдерживания в эксикаторе над твердым NaOH.

Для проведения гидролиза внутриклеточных полисахаридов 50 мг сухой делипидизованной биомассы помещали в круглодонную колбу вмесимостью 250 мл, добавляли 50 мл дистиллированной воды и 1.6 мл 25% дейтеросерной кислоты и кипятили с обратным водяным холодильником в течении 90 мин. По охлаждении реакционную смесь суспендировали в одном объёме горячей дистиллированной воды и нейтрализовали 2 н. раствором Ba(ОН)2 до рН 7.0. Выпавший осадок сульфата бария отделяли центрифугированием (15000 об/мин, 5 мин), супернатант декантировали и упаривали в роторном испарителе при 400 С.

Рост бактерий оценивали по способности к образованию отдельных колоний на поверхности твёрдых агаризованных сред, а также по величине оптической плотности суспензии клеток, измеренной на спектрофотометре Beckman-DU6 (США) при 540 нм в кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 мм.

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинках Silufol UV-254 (Чехо-Словакия) или на пластинках с закреплённым слоем селикагеля фирмы Merck (Германия) в системах растворителей: изопропанол-аммиак, (7:3) (A) для аминокислот и н-бутанол-уксусная кислота-вода, (2:1:1), (Б) для инозина.

Определение содержания глюкозы в культуральной жидкости проводили глюкозооксидазным методом [20].

Секретируемые фенилаланин и инозин определяли на приборе Beckman DU-6 (США). Фенилаланин определяли при 540 нм в образцах культуральной жидкости, объёмом 10 мкл после обработки препаратов культуральной жидкости нингидрином, инозин - при 249 нм в образцах культуральной жидкости, объёмом 20 мкл.

Аминокислотный анализ гидролизатов суммарных белков биомассы проводили на приборе Biotronic LC 5001 (ФРГ); 230 x 3,2 мм; рабочее давление 50-60 атм; скорость подачи натрийцитратного буфера 18.5; нингидрина 9.25 мл/ч; детекция при 570 нм и 440 нм (для пролина).

Анализ углеводов осуществляли на жидкостном хроматографе Knauer (ФРГ), снабженным насосом Gilson (ФРГ) и рефрактометром Waters К 401 (ФРГ); неподвижная фаза: Separon NH2, 10 мкм; 10 x 250 мм; подвижная фаза: ацетонитрил-вода, (75:25); скорость подачи: 0.6 мл/мин.

Липиды анализировали на хроматографе Beckman Gold System (США), снабжённым насосом Model 166 (США) и детектором Model 126 (США); неподвижная фаза: Ultrasphere ODS 5 мкм; 4.6 x 250 мм; подвижная фаза: линейный градиент 5 мМ KH2PO4-ацетонитрил; 100% в течении 50 мин; скорость подачи: 0.5 мл/мин; детекция при 210 нм.

Уровни включения дейтерия в аминокислоты белковых гидролизатов определяли методом масс-спектрометрии электронного удара в виде метиловых эфиров N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных (дансильных) производных аминокислот на приборе MB-80A (Hitachi, Япония) при ионизирующем напряжении 70 эВ.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.