WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

Большой практический интерес представляет реализация преимуществ препаративной обращенно-фазовой высокоэфективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) при разделении оптически чистых изотопно-меченых молекул аминокислот и их N-производных в количествах, необходимых для биоаналитических и синтетических целей [146, 147]. Так, в работе [147] описан метод препаративного разделения индивидуальных молекул аминокислот из различных микробиологических источников с помощью ОФ ВЭЖХ в виде бензилоксикарбонильных производных (N-Cbz производных) аминокислот. Разработанный метод позволяет выделять аминокислоты с высоким выходом (от 67% до 89%) и хроматографической чистотой (96-99%) [147] и может быть использован для выделения [2H]-, [13C]-, [15N] и [18O]аминокислот из белковых гидролизатов различных источников.

 

ХИМИКО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ МЕТОД ВКЛЮЧЕНИЯ АТОМОВ СТАБИЛЬНЫХ ИЗОТОПОВ В МОЛЕКУЛЫ.

 

Другим подходом по включения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот является химико-ферментативный метод, основанный на комбинации синтетических и ферментативных реакций. Для этого перспективно и экономически оправдано использование препаратов очищенных ферментов и их экстрактов, безклеточных ферментативных систем, а также иммобилизованных ферментов.

 

Ферментативные реакции осуществляют на иммобилизованных ферментах, например, таких как аланиндегидрогеназе (КФ 1.4.1.1) в присутствии NADH при получении [2H]аланина [148], иммобилизованной на сахарозе фенилаланинаммонийлиазе (КФ 4.3.1.5) и фенилаланингидроксилазе (КФ 1.14.16.1), при получении [2H]фенилаланина [149] и [2H]тирозина [150], триптофансинтазе (КФ 4.2.1.20), при получении [2H]триптофана [151], глутаматдегидрогеназе (КФ 1.4.1.2), при получении [2H]глутаминовой кислоты [152], аспартазы (КФ 4.3.1.1), при получении [2Н]аспарагиновой кислоты [153] и серингидроксиметилазе (КФ 2.5.1.6) при получении [2H]серина [154].

 

Ферментативный метод используется для препаративного лабораторного и промышленного получения оптически активных аминокислот, благодаря высокой субстратной специфичности ферментов и возможности селективного введения стабильных изотопов по определённым положениям молекул аминокислот. Основными аспектами использования ферментативных систем являются каталитические реакции ассиметрического образования связи на прохиральных субстратах и ферментативное разделение рацематов аминокислот.

 

Что касается хроматографического разделения рацематов на прохиральных сорбентах, то оно все же недостаточно эффективно для разделения и обеспечивает в лучшем случае больше половины меченого продукта в виде одного из оптических антиподов. Ферментативная стадия часто завершает химический синтез изотопномеченых аналогов аминокислот, причем использование для этих целей интактных клеток или их экстрактов так же эффективно, как использование очищенных ферментов. Однако, субстратная специфичность ферментов, их ограниченная доступность, сложность их выделения и очистки ограничивают их применение для этих целей. Несмотря на то, что ферментативные синтезы преодолевают все вышеперечисленные проблемы, низкие выхода очищенных ферментов лимитируют использование химико-ферментативных реакций. Так, разработанный ферментативный процесс для включения атомов азота 15N в молекулу аланина включает комплексное использование нескольких специфичных ферментов и меченых субстратов и имеет выход по целевому продукту не более 1 г [155]. С другой стороны, методы генной инженерии открывают возможности для получения большинства ферментных препаратов в препаративных количествах.

 

Включение изотопа азота 15N в молекулы аминокислот связано с использованием [15N]аммонийных или [15N]нитратных солей в качестве источников изотопной 15N-метки [156], в то время как ферментативный метод более эффективен для включения изотопа азота 15N в молекулы [15N]аспарагиновой и [15N]глутаминовой кислот за счёт аминирования a-кетопроизводных аминокислот и в тех случаях, когда необходимы высокие уровни включения изотопа 15N в молекулы [157].

 

Осуществление различных методов включения атомов изотопа азота 15N в молекулы аминокислот связано с использованием методов газовой подпитки 15NН3 [158], иммобилизацией клеток с последующей активацией носителя 15NН4Cl [159], или с оптимизацией концентраций [15N]предшественников аминокислот в ростовых средах [160]. C использованием вышеперечисленных подходов были получены [15N]аспарагиновая кислота и [15N]аланин с уровнями изотопного включения 15N, превышающими 95% [161]. При этом иммобилизованные клетки E. coli были использованы как источник аспартазы, которая катализирует превращение [15N]фумаровой кислоты и [15N]фумарата в [15N]аспарагиновую кислоту, в то время как для получения [15N]аланина из [15N]аспарагиновой кислоты в качестве источника аспартат-4-декарбоксилазы использовали бактерию Pseudomonas decahee. [15N]глутаминовую кислоту получали за счёт процесса ферментации бактерий Brevibacterium lactofermentum с предшественниками аминокислот в присутствии 15NNН4ОН [162].

 

Для включения атомов изотопа углерода 13С в молекулы аминокислот могут применяться аналогичные ферментативные подходы с применением [13С]глюкозы, однако при проведении ферментативной реакции требуются значительные количества высокообогащённой [13С]глюкозы и поэтому даный метод является слишком дорогим для получения [13С]аминокислот. Кроме того, большая часть глюкозы (до 70%) идёт на обеспечение процесса дыхания клетки, поэтому эффективность мечения молекул БАС изотопом углерода за счёт ферментативного окисления [13С]глюкозы невысокая. Так, уровни изотопного обогащения молекулы [13С]глутамата, полученного ферментативно с участием [13С]глюкозы, были менее 50% [163].

 

Перспективны также подходы с использованием комбинации химико-ферментативных и биотехнологических способов включения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот. В работах [164, 165] сообщается о получении более десятка аналогов молекул триптофана, специфически меченных изотопами 2Н, 13С, 15N по индольному кольцу молекулы. Моно-изотопномеченые производные индолов и их 4, 5 и 7-гидроксипроизводные были ферментативно превращены в меченые аналоги триптофана при помощи генетически сконструированного штамма бактерий E. coli, содержащего рекомбинантную плазмиду с триптофановым (Тrp) опероном, который кодировал ряд ферментов, ответственных за биосинтез этой аминокислоты.

 

Несмотря на многочисленность описанных в современной литературе подходов по включению атомов стабильных изотопов в молекулы БАС, в настоящее время практически не существует способов, которые позволяют получать аминокислоты и белки, меченные 2Н, 13С, 15N и 18O за счет того или иного универсального подхода, хотя химико-ферментативные методы позволяют использовать одну и ту же химико-биохимическую реакцию для получения меченых аминокислот за счет применения различных меченых низкомолекулярных реагентов (субстратов). Включение атомов стабильных изотопов в молекулы удобнее всего проводить с использованием биотехнологических подходов, в то время как селективности включения стабильных изотопов в молекулы БАС можно достичь за счёт применения комбинации синтетических и ферментативных реакций. Выбор метода получения молекул БАС, несущих тот или иной атом изотопа, определяется прежде всего целью исследования.

 

ЛИТЕРАТУРА.

 

1. Smith K., Barua J. M., Watt P. W. // Am. J. Physiol. - 1992. - V. 262. - N 3. - P. 1372-1376.

 

2. McIntosh L. P., Dahlquist F. W. // Quarterly Reviews of Biophysics. - 1990. - V. 23. - N. 1. - P. 1-38.

 

3. Harbison G. S., Smith S. O., Pardoen J. A., Mulder P. P. J., Lugtenburg J., Herzfeld R., Mathies R., Griffin R. G. // Biochemistry. - 1984. - V. 23. - P. 2662-2667.

 

4. Ames J. B., Ros M., Raap J., Lugtenburg J., Mathies R. A. // Biochemistry. - 1992. - V. 31. -P. 5328-5335.

 

5. Fischer M. R., de Groot H. J. M., Raap J., Winkel C., Hoff A. J., Lugtenburg J. // Biochemistry. - 1992. - V. 31. - P. 11038-11043.

 

6. Lewis A., Marcus M. A., Ehrenberg B., Crespi H. L. // Proc. Nat. Acad Sci. USA. - 1978. - V. 75. - P. 4642-4646.

 

7. Fesik S. W., Eaton H. L., Olejniczak E. T., Zuiderweg E. R. P., McIntosh L. P., Dahlquist F. W. // J. Am. Chem. Soc. - 1990. - V. 112. - P. 886-888.

 

8. Motil K. J., Montandon C. M., Thotathuchery M., Garza C. // Am. J. Clin. Nutr. - 1990. - V. 51. - P. 378-384.

 

9. Young V. R., Yu Y. M., Krempf M. Protein and amino acid turnover using the stable isotopes 15N, 13C, and 2H as probes. New techniques in nutritional research // Eds. R. G. Whitehead, A. J. - Prentice. - Academic Press. - New York, 1990. - V. 9. - P. 17-72.

 

10. Digenis G. A., Goto R., Chaney J. E., Tamemasa O. // J. Pharm. Sci. - 1982. - V. 71. - P. 816-820.

 

11. Nelson J. E., Ruo T. I. // Clinica Chemica Acta. - 1988. - V. 175. - P. 59-65.

 

12. Beaufrere B., Fournier V., Salle B., Putet G. // Am. J. Physiol. - 1992. - V. 263. - N 2. - P. 214-220.

 

13. Darmaun D., Robert J. J., Bier D. M., Matthews D. E., Young V. R. // Annales-d’Endocrinologie. - 1985. - V. 46. - N 4. - P. 355-356.

 

14. Hruby V. J. // Synth. and Appl. Isot. Label. Compounds. - 1985. - V. 4. - P. 287-292.

 

15. Viswanatha V., Hruby V. J. // J. Org. Chem. - 1980. - V. 45. - P. 2010-2015.

 

16. Fesik, S. W., Zuiderweg, E. R. P.// Quarterly Reviewes of Biophysics. - 1990. - V. 23. - N 2. - P. 97-131.

 

17. Ellman J. A., Volkman B. F., Mendel D. // J. Am. Chem. Soc. - 1992. - V. 114. - P. 7959-7961.

 

18. Griesinger C., Sorensen O. W., Ernst R. R. // J. Am. Chem. Soc. - 1987. - V. 109. - P. 7227-7228.

 

19. Zuiderweg E. R. P., McIntosh L. P., Dahlquist F. W., Fesik S. W. // J. Magn. Reson. - 1990. - V. 86. - P. 210-216.

 

20. Rothschild, K. J., Braiman, M. S., He, Yi-Wu., Marti, T., Khorana, H. G. // J. of Biol. Chem. - 1990. - V. 28. - P. 16985-16991.

 

21. Haris P. I., Robillard G. T., Vandijk A. A., Chapman D. // Biochemistry. - 1992. - V. 31. - N 27. - P. 6279-6284.

 

22. Argade, P. V., Rothschild, K. J., Kawamoto, A. H., Herzfeld, J., Herlihy, W. C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1981. - V. 78. - N 3. - P. 1643-1646.

 

23. Eisenstein L., Lin S., Dollinger G., Odashima K., Termini J., Konno K., Ding W., Nakanischi K. // J. Am. Chem. Soc. - 1987. - V. 109. - P. 6860-6862.

 

24. Irving C. S., Nissim I., Lapidot A. // Biomed. Mass. Spectrom. - 1978. - V. 5. - P. 117-122.

 

25. Raap J., Winkel C., de Wit A. H. M., van Houten A. H. H., Hoff A. J., Lugtenburg J. // Anal. Biochem. - 1990. - V. 191. - P. 9-18.

 

26. Мосин О. В., Егорова Т. А., Складнев Д. А., Швец B. И. // Биоорганическая химия. - 1996. - Т. 22. - N 10-11. - С. 861-874.

 

27. Мосин О. В. Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2Н (D) и 13С, с высокими степенями изотопного обогащения. Автореф. дис. канд. хим. наук. М.: МИТХТ им. М. В. Ломоносова. - 1996. - С. 3-23.

 

28. Мосин О. В., Егорова Т. А., Чеботаев Д. А., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. // Биотехнология. - 1996. - N 4. - С. 27-34.

 

29. LeMaster D. M. // Quarterly Reviews of Biophysics. - 1990. - V. 23. - N. 1. - P. 133-174.

 

30. Пшеничникова А. Б., Карнаухова Е. Н., Звонкова Е. Н., Швец В. И. // Биоорганическая химия. -1995. - Т. 21. - N 3. - С. 163-178.

 

31. Raap J., van der Wielen C. M., Lugtenburg J. // Recl. Trav. Chim. Pays-Bas. - 1990. - V. 109. - P. 277-286.

 

32. Winkel C., Aarts M. W. M., van der Heide F. R., Buitenhuis E. G., Lugtenburg J. // Recl. Trav. Chim. Pays-Bas. - 1989. - V. 108. - P. 139-146.

 

33. Raap J., Wolthuis W. N. E., Hehenkamp J. J. J., Lugtenburg J. // Amino Acids. - 1995. - V. 8. - P. 171-186.

 

34. van den Berg E. M. M., Baldew A. U., de Goede A. T. J., Raap J., Lugtenburg J. // Recl. Trav. Chim. Pays-Bas. - 1988. - V. 107. - P. 73-81.

 

35. van den Berg E. M. M., Richardson E. E., Lugtenburg J. // Synth. Comm. - 1987. - V. 17. - N 10. - P. 1189-1198.

 

36. Ragnarsson U. // Journal of Peptide Science. - 1995. - V. 3. - P. 149-156.

 

37. Cappon J. J., van der Walle G. A. M., Verdegem P. J. E., Raap J., Lugtenburg J. // Recl. Trav. Chim. Pays-Bas. - 1992. - V. 111. - P. 517-523.

 

38. Loftfild R. B., Eigner E. A. // Biochim. Biophys. Acta. - 1966. - V. 130. - P. 449-457.

 

39. Lugwig S. N., Unkefer C. J. // J. Labelled Compd. Radiopharm. - 1992. - V. 31. P. 95-102.

 

40. Berger A., Smolarsky M., Kurn N., Bosshard H. R. // J. Org. Chem. - 1973. - V. 38. - P. 457-460.

 

41. Daub G. H. Syntheses with stable isotopes. Stable Isotopes. Proc. of the 3d Intern. Conference. // Ed. E. R. Klein. - Academic Press. - New York, 1979. - P. 3-10.

 

42. Jones W. C., Rothgeb T. M., Gurd F. R. N. // J. Biol. Chem. - 1976. - V. 251.- P. 7452-7460.

 

43. Sternlicht H., Kenyon G. L., Packer E. L., Sinclair J. // J. Am. Chem. Soc. - 1971. - V. 93. - P. 199-208.

 

44. Giza Y. H., Ressler C. // J. Labelled Compd. - 1969. - V. 5. - P. 142-151.

 

45. Havranek M., Kopecka-Schadtova H., Veres K. // J. Labelled Compd. - 1970. - V. 6. - P. 345-354.

 

46. Wilcox M. // Anal. Biochem. - 1974. - V. 59. - P. 436-440.

 

47. Matthews H. R., Matthews K. S., Opella S. J. // Biochim. et Biophys. Acta. - 1977. - V. 497. - P. 1-13.

 

48. Bak B., Dambmann C., Nicolaisen F., Pederson E. J., Bhacca E. J. // J. Mol. Spectrosc. - 1968. - V. 26. - P. 78-97.

 

49. Griffiths, D. V., Feeney, J., Roberts, G. C. K., Burgen, A. S. V. // Biochim. et Biophys. Acta. - 1976. - V. 446. - P. 479-485.

 

50. Kinsey, R. A., Kintanar, A., Oldfield, E. // J. Biol. Chem. - 1981. - V. 256. - N 17. - P. 9028-9036.

 

51. Золотарёв Ю. А., Зайцев Д. А., Татур В. Д., Мясоедов Н. Ф. Способ получения равномерно меченных дейтерием оптически активных a-аминокислот: А. с. N 1685903 СССР. - // ВНИИГПЭ. - 1991. - N 39. - С. 92.

 

52. Золотарёв Ю. А., Козин В. С., Зайцев Д. А., Дорохова Е. Н., Мясоедов Н. Ф. // Докл. АН СССР. - 1989. - Т. 308. - N 5. - С. 1146-1150.

 

53. Samuel D. Methology of oxygen isotopes. Oxygenases. // Ed. M. Hayaishi. - Academic Press. - New York, 1972. - P. 31-86.

 

54. Bunton C. A., James D. H., Senior J. B. // J. Chem. Soc. - 1960. - P. 3364-3367.

 

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.