WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |

БИОТЕХНОЛОГИЯ

МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ, МЕЧЕНЫХ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ 2Н, 13С, 15N, 18О

@ О. В. МОСИН

Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571, г. Москва, проспект Вернадского, д.86

Данный обзор посвящён развитию современных биотехнологических и химико-ферментативных методов по получению аминокислот и белков, меченных стабильными изотопами 2Н, 13С, 15N, 18О. Рассмотрены потенциальные возможности этих методов для направленного синтеза изотопномеченых аминокислот и белков. Представлены собственные и имеющиеся в литературе данные по получению и использованию синтезированных меченых соединений в разнопрофильных биохимических исследованиях с применением методов спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной (ИК) и лазерной спектроскопии, а также масс-спектрометрии.

Ключевые слова: стабильные изотопы; микроорганизмы; биосинтез; аминокислоты и белки

ВВЕДЕНИЕ

Метод обогащения молекул стабильными изотопами (2Н, 13C, 15N, 18О и другие) является в настоящее время важным направлением в биохимических и структурно-функциональных исследованиях разнообразных природных соединений и, в частности, аминокислот и белков [1-7]. Эти изотопномеченые биологически активные соединения (БАС), полученные данным методом с различными уровнями изотопного обогащения, от селективно до униформно меченых, являются удобными инструментами для разнопрофильных метаболических и биохимических исследований [8, 9], медицинской диагностики различных заболеваний [10-13], химических синтезов разнообразных изотопномеченых соединений на их основе. Например, [2H]- и [13C]фенилаланин и [2H]- и [13C]тирозин использованы в синтезах меченых аналогов пептидных гормонов и нейропептидов [14, 15].

Тенденции к предпочтительному применению стабильных изотопов по сравнению с их радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле методами высокого разрешения: спектроскопией ЯМР [16-19], ИК- [20, 21] и лазерной спектроскопией [22, 23], масс-спектрометрией [24, 25]. Развитие этих методов детекции стабильных изотопов за последние годы позволило повысить эффективность проведения многочисленных биологических исследований de novo, а также изучать структуру и механизм действия многих клеточных БАС на молекулярном уровне.

Именно поэтому разработка путей получения аминокислот и белков, меченных стабильными изотопами, является актуальной задачей для современной биотехнологии. Однако, разные методы, используемые для введения стабильных изотопов в молекулы БАС, обычно приводят к получению препаратов, представляющих собой смеси молекул, различающихся количеством атомов, замещённых на стабильные изотопы. Поэтому необходимо разрабатывать и применять новые подходы по получению изотопномеченых БАС, основанные на использовании генно-инженерных методов, комбинации биотехнологических и химико-ферментативных подходов и т. п. В зависимости от цели исследования при реализации того или иного подхода по получению изотопномеченых аминокислот и белков должны учитываться их стоимость, выходы, возможности более полного выделения и очистки, а также изотопная чистота синтезированных продуктов. При получении изотопномеченых аминокислот и белков основные затраты связаны с закупкой сырья (субстрата), расходом электроэнергии (на перемешивание, аэрацию и процессы массопереноса) и охлаждением (теплообменом). При использовании природных сырьевых источников (пептонов, белково-витаминных концентратов и т. п.) в качестве субстратов для производства изотопномеченых БАС необходимо также учитывать расход электроэнергии, пара и топлива на предварительную глубокую обработку сырья, чтобы превратить его в поддающиеся микробиологическому воздействию соединения. Сравнительная оценка различных способов производства изотопномеченых аминокислот и белков показывает, что основные расходы здесь связаны со стоимостью сырья, составляющей 70-80% всех затрат.

Использование аминокислот и белков, меченных стабильными изотопами, в значительной мере определяется ограниченной доступностью и дороговизной самих высокоочищенных изотопов, выделяемых из различных природных источников. Природная распространенность стабильных изотопов варьирует от 0,015% (относительно общего количества элемента) для дейтерия, до 1,11% для изотопа углерода 13С, однако, несмотря на низкое содержание изотопов в пробах, разработанные в последние годы методы обогащения и очистки стабильных изотопов позволяют получать меченые субстраты высокой степени изотопной чистоты.

Несмотря на всё возрастающий мировой интерес к изотопномеченым БАС, в отечественной литературе имеются лишь немногочисленные сведения, касающиеся методов получения этих важных соединений [26-28]. Целью настоящего обзора было более полное освещение методов биотехнологического получения аминокислот и белков, меченных стабильными изотопами 2Н, 13С, 15N, 18О.

ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОТОПНОМЕЧЕНЫХ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ

Химические синтезы изотопномеченных аминокислот

Общая стратегия получения изотопномеченых аминокислот и белков показана на рис. 1. Синтетические методы получения изотопномеченых аминокислот представляют собой, как правило, модифицированный классический синтез аминокислот, в котором стадии карбоксилирования, аминирования, восстановления, гидрирования или гидролиза проводят с использованием меченых реагентов, содержащих стабильные изотопы 2Н, 13С, 15N, 18О с соответствующим уровнем изотопной чистоты. В частности, для синтеза [2Н]-, [15N]- и [18О]аминокислот используют 2Н2О; 2H2; 2HCl; LiAl2H4; B22H6; 15NH3; Na15NH2; 15NH2Cl, 18H2O и др. (более подробно о методах получения [2H]-и [15N]аминокислот см. обзоры [29, 30]).

Особую ценность для многих исследований имеют [13C]аминокислоты, которые можно получать за счёт карбоксилирования соответствующих органических соединений с помощью 13CO2 и Ni(13CO)4 по связи углерод-водород или углерод-металл с последующим гидролизом. Перспективные синтетические подходы по получению [13C]аминокислот, меченных изотопом углерода 13С по различным положениям молекул, включая карбоксильные СООН- и Сa- положения, продемонстрированы в работах [31-36], а также описан стереоселективный синтез [13С]аминокислот [37-39]. Несмотря на это, химические синтезы всё же часто многостадийны, требуют больших расходов ценных реагентов и меченых субстратов и приводят в результате к продукту, представляющему собой рацемическую смесь D- и L-форм аминокислот, для разделения которых требуются специальные методы [40]. Значительным недостатком метода является то, что он приводит к синтезу [13С]аминокислот, у которых атомы углерода 13С локализуются по карбоксильным СООН-положениям молекул. Последнее существенно ограничивает использование данных [13C]аминокислот для биологических исследований вследствие возможной потери изотопной метки 13С за счёт функционирования многочисленных реакций ферментативного декарбоксилирования, происходящих в организме [41]. Кроме этого, до настоящего времени практически не существует подходящего метода для введения изотопа 13C в положения углеродных атомов боковых радикалов молекул аминокислот, так чтобы каждая стадия химического синтеза была бы развита детально. Разработанные за последние годы синтетические методы введения 13C-метки в аминокислоты затрагивают, как правило, такие положения углеродных атомов в молекулах аминокислот, как метильная СН3- группа метионина [42], С2- положение в имидазольном кольце молекулы гистидина [43], а также атомы углерода при карбоксильных СООН- группах аспарагиновой [44], и глутаминовой кислот [45].

Более тонкие синтезы изотопномеченых аминокислот были связаны с использованием комбинации химических и ферментативных подходов. Например, L-[4-13C]валин, L-[3-13C]триптофан и другие L-[13C]аминокислоты, были синтезированы с использованинем препаратов ферментов [46] (более подробно о химико-ферментативных подходах по синтезу изотопномеченых аминокислот см ниже).

Изотопный (1Н-2Н)- и (16О-18О)-обмен в молекулах аминокислот и белков.

Весьма эффективным подходом для препаративного получения [2H]аминокислот является селективное замещение определённых легко обмениваемых на дейтерий ароматических протонов в бензольном кольце фенилаланина и тирозина, в индольном кольце триптофана и в имидазольном кольце гистидина, как в виде индивидуальных аминокислот, так и в составе аминокислотных остатков в белках [47, 48].

Реакция изотопного (1Н-2Н)-обмена протекает по механизму электрофильного замещения и затрагивает лишь определённые, наиболее чувствительные к замещению протоны в ароматических аминокислотах. Этим методом могут быть получены в граммовых количествах L-[2,3,4,5,6-2Н]фенилаланин в 85% 2H2SO4 при 500 C, L-[3,5-2H]тирозин в 6 н. 2H2SO4 при слабом кипячении раствора, L-[2,4,5,6,7-2H]триптофан в 75% [2H]трифторуксусной кислоте при 250 С и L-[2-2H]гистидин в 6 н. NaO2H при 800 С.

Вследствие того, что замещаемые на дейтерий протоны в молекулах белков прочно связаны с атомами углерода и трудно обмениваются на дейтерий в мягких условиях, метод несколько лимитируется из-за нестабильности белков в жестких условиях (85-90% НCl/H2SO4, 80-1000 C), необходимых для проведения реакции изотопного обмена [49]. Кроме того, проведение изотопного обмена в более жёстких условиях сопровождается рацемизацией аминокислот. Избежать этого позволяет непосредственное введение полученных за счёт (1Н-2Н)-обмена дейтерированных аналогов аминокислот - L-[2,3,4,5,6-2Н]фенилаланина, L-[3,5-2H]тирозина и L-[2,4,5,6,7-2H]триптофана в молекулы индивидуальных белков, например, в бактериородопсин, синтезируемый бактерией Halobacterium halobium [50].

Недавно разработан новый метод получения равномерно меченых α-[2H]аминокислот (глицин, аланин, валин, изолейцин, серин, треонин, пролин, гистидин) реакцией высокотемпературного твёрдофазного каталитического изотопного обмена [51, 52]. В соответствии с этим методом L-аминокислота в протонированой форме реагирует с газообразным дейтерием при 200-2500 С в присутствии высокодисперстного катализатора группы платины (Pt, Pd, Rh), и неорганического носителя (BaSO4, CaCO3, Al2O3).

С помощью изотопного обмена можно также получать и [18O]аминокислоты. Для этого используют реакцию изотопного (16О-18О)-обмена по атомам кислорода карбоксильных СООН- групп в молекулах аминокислот в присутствии Н218О в качестве источника метки [53]. Использование этого метода лимитируется высокой стоимостью полученных таким способом [18О]аминокислот. Однако, он полностью оправдывает себя при проведении многочисленных биомедицинских исследований с применением синтезированных [18O]аминокислот, так как они, в отличие от их дейтерированных аналогов, стабильны по отношению к обратному изотопному обмену. Например, [18О]аминокислоты стабильно существовали в плазме крови в течении нескольких дней после инъекции: обратный изотопный (18О-16О)-обмен по карбоксильным положениям в молекуле [18О]тирозина и других [18O]аминокислот проявлялся лишь при длительной инкубации клеток крови с питательной средой [54].

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОТОПНОМЕЧЕНЫХ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ

Выращивание микроорганизмов на средах, содержащих стабильные изотопы.

Для многих целей, и прежде всего для структурных исследований белков, биотехнология предлагает альтернативный химическому синтезу путь получения изотопномеченых аминокислот и белков, который приводит к высоким выходам синтезируемых продуктов, к эффективному включению изотопов в молекулы соединений, и, самое главное, к сохранению природной конфигурации (стереоселективности) конечных продуктов [55, 56]. Метод заключается в выращивании штаммов-продуцентов необходимых БАС на ростовых средах, содержащих различные субстраты, представляющие собой органические соединения и неорганические соли, содержащие стабильные изотопы 2Н, 13С, 15N и 18О [57-61].

Решающее значение для биотехнологического получения изотопномеченых аминокислот и белков имеет правильный выбор микроорганизмов, способных к устойчивому росту на средах, содержащих стабильные изотопы и к продукции нужных БАС. Наиболее доступными объектами для получения многих изотопномеченых белков признаны микроводоросли, большое разнообразие которых в природе позволяет выбирать среди них отдельные виды, способные к эндогенному накоплению белков [62]. В то же время комплексное использование компонентов меченой биомассы микроводорослей позволяет выделять, например, [2H]аминокислоты, в том числе и гетеромеченые, из гидролизатов суммарных белков биомассы, выращенной на 2Н2O-среде [63]. Другие традиционные штаммы микроорганизмов также могут эффективно применяться для получения изотопномеченых аминокислот и белков. При этом основными требованиями к микроорганизмам, используемым для получения изотопномеченых соединений являются устойчивый рост на средах, содержащих стабильные изотопы и высокий уровень продукции нужных БАС, который можно повысить за счёт применения генно-инженерных методов, а также мутагенеза и селекции. Это создаёт предпосылки для конструирования новых бактериальных штаммов-продуцентов с заданными свойствами и для дальнейшего изучения их характеристик. Биотехнологический подход экономически целесообразен и особенно незаменим, когда необходимы высокая стереоселективность и максимальные уровни изотопного обогащения синтезируемых соединений.

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.