WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Фракционирование и тщательная хроматографическая очистка белка являлись следующим важным этапом. Поскольку БР, будучи трансмембранным белком (Мr 26.7 кД), пронизывает билипидный слой в виде семи α-спиралей, применение сульфата аммония и других традиционных высаливающих агентов не дает положительного результата. Решение проблемы заключалось в переводе белка в растворимую форму солюбилизацией в 0.5% ДДС-Na. Использование ионного детергента ДДС-Na диктовалось необходимостью максимальной солюбилизации белка с комбинированием стадии делипидизации и осаждения в нативном виде, поскольку солюбилизированный в слабоконцентрированном растворе ДДС-Na (0.5%) БР, сохраняет спиральную α-конфигурацию [9]. Поэтому отпала необходимость использования органических растворителей ацетона, метанола и хлороформа для очистки от липидов, а делипидизация и осаждение белка совмещались в одну единственную стадию, существенно упрощающую фракционирование. Значительным преимуществом метода является, что целевой белок в комплексе с молекулами липидов и детергента распределяется в надосадочной жидкости, а другие высокомолекулярные примеси - в непрореагировавшем осадке, легко отделяемом центрифугированием. Фракционирование солюбилизованного в 0.5% ДДС-Na белка с его последующим выделением в кристаллическом виде достигали в три стадии дробным низкотемпературным (-50С) осаждением метанолом, уменьшая концентрацию детергента соответственно в 2.5 и 5 раза. Окончательная стадия очистки БР заключалась в отделении белка от низкомолекулярных примесей методом гель-проникающей хроматографии, для чего БР-содержащие фракции дважды пропускали через колонку с декстрановым сефадексом G-200, уравновешенную 0.09 М Трис-боратным буфером (рН 8.35) с 0.1% ДДС-Na и 2.5 мМ ЭТДА (рис. 6). Согласно разработанному методу удалось получить 8-10 мг 2Н-меченого БР из 1 г бактериальной биомассы, гомогенность которого удовлетворяла требованиям, предъявляемым для реконструкции мембран и подтверждалась электрофорезом в 12.5% ПААГ с 0.1% ДДС-Na, регенерацией апомембран с транс-ретиналем и обращенно-фазовой ВЭЖХ метиловых эфиров N-Днс-аминокислот. Небольшой выход БР не был препятствием для последующего масс-спектрометрического анализа, однако здесь необходимо подчеркнуть, что для обеспечения высокого выхода белка необходимо наработать большее количество сырьевой биомассы.

Важным этапом эксперимента являлся гидролиз дейтерий-меченного бактериородопсина, который было необходимо проводить в условиях предотвращения изотопного обмена водорода на дейтерий и сохранения остатков триптофана в белке. Рассматривались два альтернативных варианта - кислотный и щелочной гидролиз. Кислотный гидролиз белка в стандартных условиях (6 н. HСl или 8 н. H2SO4, 1100С, 24 ч) приводит к полному разрушению триптофана и частичному разрушению серина, треонина и некоторых других аминокислот в белке. Модификация этого метода, заключающаяся в добавлении в реакционную среду фенола [11], тиогликолевой кислоты [12], β-меркаптоэтанола [13], позволяет сохранить до 80-85% триптофана. Использование п-толуолсульфокислоты с 0.2% 3-(2-аминоэтил)-индолом или 3 М меркаптоэтансульфокислоты [14] также эффективно для сохранения триптофана (до 93%) [15]. Однако для решения поставленной задачи вышеперечисленные методы непригодны, поскольку обладают существенным недостатком: в условиях кислотного гидролиза с высокой скоростью происходит изотопный обмен ароматических протонов (дейтеронов) в молекулах триптофана, тирозина и гистидина [16], а также протонов при атоме С3 аспарагиновой и С4 глутаминовой кислот [17]. Поэтому даже проведение гидролиза в дейтерированных реагентах (6 н. 2HCl, 4 н. 2H2SO4 в 2H2O) не позволяет получать реальные данные о включении дейтерия в белок.

В условиях щелочного гидролиза (4 н. Ba(OH)2 или 4 н. NaOH, 1100C, 24 ч) реакций изотопного обмена водорода практически не наблюдается (исключением является протон (дейтерон) у атома С2 гистидина, а триптофан не разрушается. Однако, при проведении щелочного гидролиза возможна D,L-рацемизация аминокислот. Но этот факт не играл для наших исследований существенной роли. Поэтому мы отдали предпочтение щелочному гидролизу. Упрощение процедуры выделения смеси свободных аминокислот за счет нейтрализации серной кислотой явилось причиной выбора в качестве гидролизующего агента 4 н. раствор Ba(OH)2. Для последующего масс-спектрометрического анализа гидролизаты бактериородопсина обрабатывали дансилхлоридом и диазометаном (и/или карбобензоксихлоридом) с получением летучих производных аминокислот, которые затем разделяли методами обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Рис. 7. Полный масс-спектр ЭУ метиловых эфиров метиловых эфиров N-Днс-производных аминокислот гидролизата БР. Условия выращивания: синтетическая среда с N-Днс-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланином, N-Днс-[3, 5-2H2]тирозином и N-Днс-[2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофаном. На рис 4 и 5 пики молекулярных ионов аминокислот соответствуют их производным. I- интенсивность пиков.

После того, как бактериородопсин был успешно выделен из мембран бактерий H.halobium и был гидролизован до отдельных аминокислот было необходимо исследовать уровни обогащения дейтерия в ароматических аминокислотах. Анализ степени дейтерированности аминокислот гидролизата бактериородопсина удобнее всего проводить методом масс-спектрометрии электронного удара EI на приборе “MB-80 A” (Hitachi, Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ. Полный масс-спектр электронного удара смеси метиловых эфиров N-Днс-производных аминокислот, показанный на рис. 7 (сканирование при m/z 50-640, базовый пик m/z 527, 100%), отличался непрерывностью. Пики в интервале m/z от 50 до 400 на шкале массовых чисел представлены фрагментами метастабильных ионов, низкомолекулярных примесей, а также продуктами химической модификации аминокислот. Анализируемые 2Н-меченые ароматические аминокислоты, занимающие шкалу массовых чисел m/z от 415 до 456 представляли собой смеси молекул с различным количеством включенных атомов дейтерия, поэтому молекулярные ионы (М)+ полиморфно расщеплялись на отдельные кластеры со статистическим набором значений m/z зависимости от количества водородных атомов в молекуле. Учитывая эффект изотопного полиморфизма, подсчет уровня дейтерированности молекул аминокислот проводился по наиболее распространенному пику молекулярного иона (М)+ в каждом кластере с математически усредненной величиной (М)+ (рис. 7) - для фенилаланина пик молекулярного иона определялся (М)+ при m/z 417, 14% (вместо (М)+ при m/z 412, 20% для немеченого производного (пики немеченых аминокислот не показаны)), тирозина - (М)+ при m/z 429, 15% (вместо (М)+ при m/z 428, 13%), триптофана - (М)+ при m/z 456, 11% (вместо (М)+ при m/z 451, 17%). Уровень дейтерированности, соответствующий увеличению молекулярной массы составил для тирозина два, фенилаланина и триптофана - пять атомов дейтерия. Полученные данные по уровню дейтерированности фенилаланина, тирозина и триптофана позволяют сделать вывод о высокой селективности включения 2H-меченых ароматических аминокислот в молекулу БР. Дейтерий детектировался во всех остатках ароматических аминокислот (таблица). Однако, следует подчеркнуть, что присутствие в масс-спектре пиков (M)+ протонированных и полудейтерированных аналогов фенилаланина с (M)+ при m/z 413-418, тирозина с (M)+ при m/z 428-430 и триптофана с (M)+ 453-457 с различными вкладами в уровни дейтерированности молекул, свидетельстствует о сохранении небольшой доли минорных путей биосинтеза de novo, приводящим к разбавлению дейтериевой метки и, по-видимому, определяется самими условиями биосинтеза 2Н-меченного БР (таблица).

Таблица. Величины пиков (М)+ в масс-спектре электронного удара метиловых эфиров N- Dns-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланина, N-Dns-[3, 5-2H2]тирозина и N-Dns-[2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофана.

Соединение

Величина пика (М)+

Интенсив-ность, %

Количество атомов дейтерия

Уровень дейтерированности, % от общего количества атомов водорода

N- Dns-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]Phe-Ome

413

414

415

416

417

418

7

18

15

11

14

6

1

2

3

4

5

6

13

25

38

50

63

75

N-Dns-[3, 5-2H2]Tyr-OMe

428

429

430

12

15

5

-

1

2

-

14

29

N-Dns-[2, 4, 5, 6, 7-2H5]Trp-OMe

453

454

455

456

457

5

6

9

11

5

2

3

4

5

6

26

38

50

64

77

Согласно данным масс-спектрометрического анализа, пики молекулярных ионов (М)+ метиловых эфиров N-Днс-производных ароматических аминокислот обладали очень низкой интенсивностью и полиморфно расщеплялись, поэтому области их молекулярного обогащения были сильно уширены. Кроме этого, масс-спектры компонентов смеси аддитивны, поэтому смеси можно анализировать, только если имеются спектры различных компонентов, записанные в тех же условиях [18]. Проводимые вычисления предусматривают решение системы из n уравнений с n неизвестными для смеси из n компонентов. Для компонентов, концентрация которых превышает 10 мол.%, правильность и воспроизводимость результатов анализа составляет +0.5 мол.% (при доверительной вероятности 90%). Поэтому для получения воспроизводимого результата необходимо хроматографически выделять индивидуальные производные 2Н-меченых аминокислот из белкового гидролизата.

Для решения поставленной задачи мы использовали метод обращенно-фазовой ВЭЖХ на октадецилсилановом селикагеле силасорб С18, эффективность которого подтверждалась разделением смеси метиловых эфиров N-Днс-производных 2Н-меченых аминокислот из других микробных объектов, как метилотрофные бактерии и микроводоросли [19]. Метод удалось адаптировать к условиям хроматографического разделения смеси метиловых эфиров N-Днс-производных аминокислот гидролизата БР, заключающийся в оптимизации соотношения элюентов, форме градиента и скорости элюции с колонки. Наилучшее разделение достигалось при градиентной элюции метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот смесью растворителей ацетонитрил : трифторуксусная кислота = 100 : 0.1 - 0.5, об.%. При этом удалось разделить триптофан и трудно разрешимую пару фенилаланин/тирозин. Степени хроматографической чистоты выделенных метиловых эфиров N-Днс-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланина, N-Днс-[3, 5-2H2]тирозина и N-Днс-[2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофана составили 89, 91 и 90% при выходах 78-85%.

Наши выводы подтвердил рис. 8, б на котором приведен масс-спектр электронного удара метилового эфира N-Днс-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланина, выделенного обращенно-фазовой ВЭЖХ (сканирование при m/z 70-600, базовый пик m/z 170, 100%) (масс-спектр приведен относительно немеченого метилового эфира N-Днс-фенилаланина (а), сканирование при m/z 150-700, базовый пик m/z 250, 100%). Доказательством включения дейтерия в молекулу фенилаланина является пик тяжелого молекулярного иона метилового эфира N-Днс-фенилаланина ((М)+ при m/z 417, 59% вместо (М)+ при m/z 412, 44% для немеченого производного фенилаланина) и дополнительный пик бензильного фрагмента фенилаланина С7Н7+ при m/z 96, 61% (вместо m/z 91, 55% в контроле (не показан)) (рис. 8, б). Пики второстепенных фрагментов различной интенсивности со значениями m/z 249, 234 и 170 принадлежат к продуктам вторичного распада дансильного остатка до N-диметиламинонафталина, низкоинтенсивный пик (M - COOCH3)+ при m/z 358, 7% (m/z 353, 10%, контроль) является продуктом отщепления карбоксиметильной СООСН3-группы из метилового эфира N-Днс-фенилаланина, а пик (M + CH3)+ при m/z 430, 15% (m/z 426, 8%, контроль) - продуктом дополнительного метилирования по α-аминогруппе фенилаланина (рис. 8, б). Согласно данным масс-спектра, разница между молекулярной массой легкого и тяжелого пиков [M]+ метилового эфира N-Днс-фенилаланина составляет пять единиц, что совпадает с полученными ранее данными по уровню дейтерированности исходного [2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланина, добавляемого в среду выращивания (масс-спектрометрические данные по уровням дейтерированности [2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланина, [3, 5-2H2]тирозина и [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофана подтверждены спектроскопией 1Н ЯМР и находятся в корреляции).

Рис. 8. Масс-спектры метилового эфира N-Днс-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланина в различных экспериментальных условиях: немеченный метиловый эфир N-Днс-фенилаланина (а); метиловый эфир N-Днс-[2, 3, 4, 5, 6-2H5]фенилаланина, выделенный из гидролизата БР методом обращённо-фазовой ВЭЖХ.

Предложенный нами метод биосинтеза дейтерий-меченного бактериородопсина свидетельствует о высокой эффективности мечения белка по остаткам дейтерий-меченных ароматических аминокислот. Метод также применим к получению и других дейтерий-меченных мембранных белков. В дальнейшем планируется получать по разработанному методу полностью дейтерированные препараты бактериородопсина для реконструкции функционально активных систем мембранных белков в тяжёлой воде с участием дейтерий-меченных липидов и других дейтерированных биологически активных соединений. Эти исследования позволят дать ответ на вопрос как функционирует дейтерий-меченный бактериородопсин в составе нативных мембран в условиях, близким к адаптации клетки к тяжёлой воде.

ЛИТЕРАТУРА

1. Oesterhelt D., Stoeckenius W. // Nature. 1971. V. 233. N 89. P.149-160

2. Мосин О.В., Егорова Т.А., Чеботаев Д.В., Складнев Д.А., Юркевич А.М., Швец В.И. // Биотехнология. 1996. N 4. С. 27-35.

3. Karnaukhova E.N., Niessen W. M.A., Tjaden U.R. // Anal. Biochem. 1989. V. 181. N 3. P. 271-275

4. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. // Биоорган. химия. 1996. Т. 22. N 10-11. С. 856-869.

5. Mosin O.V., Karnaukhova E.N., Pshenichnikova A.B., Reshetova O.S. Electron impact mass-spectrometry in bioanalysis of stable isotope labeled bacteriorhodopsin / in: 6th Intern. Conf. on Retinal proteins. 1994. Leiden, the Netherlands, P. 115.

Pages:     | 1 || 3 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.