WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 |
удК 615. 281 [6:539] – 022.532 Оригинальная статья взаимодейСтвие экСтракта чиСтотела Большого С плазмидной днк, выделенной из клиничеСкого штамма eSHeRICHIA COLI И.В. Бабушкина – ФГУ СарНИИТО Росмедтехнологий, старший научный сотрудник отдела лабораторной и функциональной диагностики, кандидат медицинских наук; А.А. Свистунов – ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Росздрава, первый проректор, заведующий кафедрой общей и клинической фармакологии, доктор медицинских наук, профессор; Х.-М.П. Чомаев – ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Росздрава, аспирант кафедры биологической химии; Е.Г. Чеботарева – ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Росздрава, ассистент кафедры биологической химии, кандидат медицинских наук; Н.А. Бельская – ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Росздрава, доцент кафедры биологической химии, кандидат медицинских наук.

INteRACtION OF GReAteR CeLANDINe eXtRACt AND PLASMID DNA eXCReteD OF eSCHeRICHIA COLI CLINICAL CULtURe I.V. Babushkina – Saratov Scientific Research Institute of Traumatology and Orthopedics, Department of Laboratory and Functional Diagnostics, Chief Research Assistant, Candidate of Medical Science; A.A. Svistunov – Saratov State Medical University, First Pro-rector, Head of Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology, Professor, Doctor of Medical Science; H.-М.P. Chomaev– Saratov State Medical University; Department of Biochemistry, Post-graduate; E.G. Chebotarjova – Saratov State Medical University, Department of Biochemistry, Assistant, Candidate of Medical Science; N.A. Belskaya – Saratov State Medical University;

Department of Biochemistry, Assistant Professor, Candidate of Medical Science.

дата поступления – 21.05.09 г. дата принятия в печать – 26.06.09 г.

И.В. Бабушкина, А.А. Свистунов, Х.-М.П. Чомаев и соавт. Взаимодействие экстракта чистотела большого с плазмидной ДНК, выделенной из клинического штамма Esherichia Coli. Саратовский научно-медицинский журнал, 2009, том 5, № 3, с. 310-312.

Поиск соединений, обладающих антибактериальной активностью и влияющих на плазмидную дНК, — одна из важных задач практической медицины. Природные вещества являются наиболее желательными кандидатами на эту роль.

Выделение плазмидной дНК проводили из штамма esherichia coli, полученного от больного Н., страдающего хроническим пиелонефритом, в бактериологической лаборатории Областной клинической больницы г. Саратова по модифицированному методу Birnboim и Doli. Производили подсчет концентрации алкалоидов (сангвинарина и хелеретрина), содержащихся в экстракте чистотела.

Разработанная методика была апробирована на пяти образцах настойки чистотела, заложенных на хранение для изучения стабильности содержания алкалоидов и других показателей качества данного препарата, при этом содержание суммы алкалоидов в настойке составляло 1%. Обнаружено уменьшение концентрации плазмидной дНК после обработки клеток экстрактом чистотела.

Ключевые слова: экстракт чистотела, плазмидная дНК, esherichia coli.

I.V. Babushkina., A.A. Svistunov, H.-М.P. Chomaev et al. Interaction of Big Celandine Extract and Plasmid DNA, Excreted From the Clinical Strain Escherichia Coli. Saratov Journal of Medical Scientific Research, 2009, vol. 5, № 3, p. 310-312.

Search for compounds which possess antibacterial activity and have an effect on plasmid DNa, is one more of the important problems of applied medicine. Natural substances are the most desirable candidates for this role.

Plasmid DNa excretion was carried out from the strain echerihiacoli, derived from patient N., who suffered from chronic pyelonephritis, in the bacteriological laboratory of the Regional clinical hospital of Saratov according to the modified method Birnboim and Doli. The calculation of alkaloid concentration was made, e.g. Sanguinarin and cheleretrin contained in celandine extract.

The devised method has been tested on five celandine tincture samples, stored for the research of the stability of the content of alkaloids and other quality factors of the given preparation. in so doing the content of the alkaloid sum in tincture changes within the limits of 1 %. abatement of plasmid DNa concentration after the cell treatment by celandine extract is revealed.

Key words: celandine extract, plasmid DNa, esherichia coli.

используются штаммы Escherichia coli: hB101, K-12, Введение. Госпитальные инфекции остаются c-600 и другие. Спектр грамотрицательных микроодной из основных проблем медицины в настоящее организмов, которые обнаруживаются при посеве на время. Плазмидные дНК бактериальных клеток являсреды от больных, находящихся на лечении в стациются главным генетическим маркером антибиотикоуонаре, достаточно обширен и включает в себя такие стойчивости микроорганизмов [1]. Выделение плазбактериальные штаммы, как: Pseudomonas aerugiмидных дНК из бактериальных клеток, как правило, nosa, Serratia plymuthica, Klebsiella, Proteus vulgaris, осуществляется согласно хорошо апробированным E.coli, Citrobacter [3].

методикам, которые были разработаны для эталонестественно предположить, что строение клеточных штаммов микроорганизмов и с успехом применой стенки у таких штаммов, а также их метаболизм няются в различных областях молекулярной биолобудут существенно различаться. Подбор условий для гии [2]. В качестве эталонных штаммов, в основном, оптимального роста и последующего лизиса клеток представляет собой отдельную задачу, решение коОтветственный автор – Бабушкина Ирина Владимировна, торой можно ожидать на пути последовательного эм410002 г. Саратов, ул. чернышевского, 148, пирического перебора наиболее доступных методов тел. 89272233881.

e-mail: sarniito-lab@yandex.ru выращивания и лизирования клеточной биомассы.

Саратовский научно-медицинский журнал. 2009. том 5. № 3.

BIOCHeMIStRY Поиск соединений, обладающих антибактериаль- х г – 1 % ной активностью, — еще одна важная задача прак- х = 1ч1/100 = 10–2 г тической медицины. Природные вещества являются Известно, что молекулярная масса сангвинанаиболее желательными кандидатами на эту роль. рина составляет 353 г/М, а молекулярная масса Материалы и методы. для исследований исполь- хелеретрина равна 367 г/М. таким образом можзовали сбор чистотела большого, произрастающего но рассчитать концентрацию алкалоидов в 10 мл в районе Кумысной поляны города Саратова. Сбор растворителя (исходный объем растворителя для проводили в начале цветения (май), так как именно в экстракта чистотела большого). усредним молекуэтот период количественный и качественный состав лярные массы сангвинарина и хелеретрина: (353 + алкалоидов является оптимальным [4]. Собранные 367)/2 = 360 г/М.

растения подвергали естественной сушке в тени. Отm СМ =, деляли листья и измельчали в фарфоровой ступке.

M Vдля получения водного экстракта навеску растительного материала массой 1г заливали 10мл дистиллигде СМ – концентрация алкалоидов в М/л, m – масса рованной воды. экстракцию осуществляли в течение алкалоида в г, М – молекулярная масса алкалоидов в 15 минут при температуре 80єС. Методика количег/М, V0 – объем используемого растворителя в л.

ственного определения суммы алкалоидов в настой10-2 г ке чистотела следующая. 20 мл настойки чистотела СМ = 2,810-3 М / л, помещают в круглодонную колбу вместимостью 360г / М 10-2 л мл и упаривают под вакуумом на ротационном испатакая концентрация алкалоидов обнаруживается рителе до 1/4 исходного объема. Полученный остав 10 мл раствора, приготовленного описным выше ток количественно переносят в делительную воронку методом.

вместимостью 50-100 мл, прибавляют 8 мл 25%-ного Выделение плазмидных дНК раствора аммиака и алкалоиды трижды извлекают Определение антибактериального действия соехлороформом (порциями по 20, 20 и 10 мл соответдинений чистотела на бактериальные клетки штамственно). Объединенные хлороформные извлечения ма e. coli, выделенного от больного Н., страдающего дважды обрабатывают 5%-ным раствором серной хроническим пиелонефритом, проводили в бактекислоты в делительной воронке вместимостью 50– риологической лаборатории Областной клинической 100 мл порциями по 20 мл. К объединенным сербольницы г. Саратова.

нокислым извлечениям прибавляют 8 мл 25%-ного В большинстве методов выделения плазмидных раствора аммиака и основания алкалоидов вновь дНК используют биомассу, полученную в результате трижды экстрагируют хлороформом в делительной выращивания бактерий в течение 18 часов в 1-1,5 мл воронке вместимостью 50-100 мл порциями по 20, среды при температуре 37оС.

и 10 мл соответственно. Объединенные хлороформбольший объем культуральной среды нежелатеные извлечения переносят в круглодонную колбу лен, так как препарат геномной дНК будет слишком вместимостью 100 и 250 мл и отгоняют хлороформ концентрированным и с таким препаратом трудно досуха под вакуумом.

производить последующие действия.

Сухой остаток количественно переносят в стакан для быстрого выделения плазмид используют для титрирования последовательно с помощью клетки, которые берут непосредственно с чашки с мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл ацетонитрила агаром. трудность состоит в том, что при соскобе и титруют потенциометрически раствором хлорной надо избегать захвата агара (он будет мешать при кислоты (0.05 моль/л). Параллельно проводят конпоследующий работе), поскольку ингибирует активтрольный опыт.

ность большинства рестриктирующих эндонуклеаз и Массовую долю х (в %) суммы алкалоидов в педругих ферментов, работающих на дНК; этим ингиресчете на сангвинарин и хелеретрин в препарате битором, возможно, являются содержащиеся в агаре вычисляют по формуле сульфонированные углеводороды. Размер соскоба (V - V1) * 0, 01765 *не должен превышать 2-х рисовых зерен, чтобы поX =, сле ресуспендирования клеток их концентрация в растворе не превышала нужную.

где 0,01765 – количество суммы алкалоидов в переВажным фактором является время выращивания счете на сангвинарин и хелеретрин, соответствуюкультур. Оно не должно превышать 16–18 часов. При щее 1 мл раствора хлорной кислоты (0.05 моль/л), г, таком времени рост культур еще находится в логаV – объем хлорной кислоты (0.05 моль/л), пошедшей рифмической фазе, что дает большой выход плазна титрирование суммы алкалоидов, мл; V1 – объем мидной дНК.

хлорной кислоты (0.05 моль/л), пошедшей на титрилизис биомассы, как правило, является первым рование в контрольном опыте, мл.

этапом многих методов выделения плазмид. для Разработанная методика была апробирована на разрушения клеточной стенки биомассу обрабатывапяти образцах настойки чистотела, заложенных на ют эдтА и лизоцимом. Под действием эдтА разрухранение для изучения стабильности содержания шается наружная мембрана, а лизоцим расщепляет алкалоидов и других показателей качества данного мукопептидный слой.

препаратах [5, 6]. При этом содержание суммы алкаКультуры микроорганизмов выращивали в 5 мл 10% лоидов в настойке колеблется в пределах 1%.

питательной среды на основе бульона хоттингера в теПодсчет концентрации алкалоидов (по всей верочение 18 часов в термостате при температуре 37 оС.

ятности, сангвинарина и хелеретрина), содержащихЗатем 1 мл бульонной культуры отбирали в мися в экстракте чистотела, производили следующим кропробирки и концентрировали микробные клетки образом. Поскольку навеска составляла один грамм, центрифугированием при 14000 об/мин в течение а количество алкалоидов 1%, то рассчитывали колиминуты. Осадок ресуспендировали в 100 мкл расчество алкалоидов в 1 г сырья чистотела большого:

твора № 1, содержащего лизоцим “Serva” (2 мг/мл) 1 г – 100 % Saratov Journal of Medical Scientific Research. 2009. Vol.5. № 3.

312 Биохимия оставляли в ледяной бане на 10 минут. лизоцим рас- Модификация метода состоит в том, что, вотворяли в растворе № 1 непосредственно перед ис- первых, по сравнению со стандартным выделением пользованием.

плазмидной дНК по методу Birnboim и Doli, уменьПо истечении 10 минут к смеси добавляли шено время выдержки в ледяной бане; во-вторых, мкл раствора № 2. Микропробирки один раз резко не применялась баня, содержащая смесь сухого встряхивали и снова помещали в ледяную баню на льда и этанола; в-третьих, использование отечеминут. Затем в пробирки добавляли по 150 мкл расственных центрифуг на 8 000-10 000 об/мин (3.577.твора № 3, встряхивали 1–2 раза, хорошо перемешиg) нисколько не снизило процент выхода плазмидвали и оставляли в ледяной бане на 30 минут.

ной дНК.

После этого микропробирки центрифугировали в Результаты. электрофоретические профили течение 15 минут при 14 000 об/мин. Супернатант отплазмидных дНК, выделенных после обработки бирали в чистые микропробирки, приливали к нему исходных бактериальных клеток экстрактом чи400 мкл фенола и центрифугировали в течение 5 мистотела, представлены на рисунке. Обращает на нут при 14 000 об/мин. После этого отбирали верхсебя внимание уменьшение концентрации плазнюю фазу, не содержащую фенол, и добавляли к ней мидной дНК после обработки клеток экстрактом 400 мкл хлороформа, после чего центрифугировали чистотела.

в течение 10 минут при 14 000 об/мин.

Обсуждение. Алкалоиды имеют в своей структуЗатем снова переливали верхнюю фазу, не соре положительно заряженный атом азота. Возможно держащую хлороформа, в чистые микропробирки возникновение электростатических сил притяжения и добавляли 40 мкл 3М ацетата натрия и 1000 мкл между отрицательно заряженным сахарофосфатным 96%-ного перегнанного этанола, перемешивали и остовом дНК и положительным атомом азота. Крооставляли содержимое на 15–30 минут при темпераме положительного атома азота, алкалоиды имеют туре –20 оС.

структуру плоских ароматических колец, которые, по На следующем этапе содержимое пробирок ценвсей видимости, могут интеркалировать в двойную трифугировали в течение 15 минут при 14 000 б/мин.

спираль дНК, изменяя структуру последней, в отлиЗатем удаляли супернатант, а к осадку добавляли 250 мкл 70%-ного охлажденного при температуре чие от односпиральных РНК, поскольку не обнаруже–20оС этанола, несколько раз осторожно перево- но прямого взаимодействия между РНК и компоненрачивали пробирки для того, чтобы лучше промыть тами экстракта чистотела [7]. Отсутствие подобного осадок, и снова центрифугировали в течение 2 мин взаимодействия иллюстрирует спектр поглощения при 14 000 об/мин.

экстракта чистотела в присутствии РНК в кюветах После этого вновь удаляли супернатант, а остатки сравнения и определения. На спектрах поглощения жидкости удаляли с помощью полосок фильтровальэкстракта чистотела большого не обнаружено сменой бумаги. Осадок просушивали на воздухе при отщения спектральных полос, что указывало бы на крытой крышке микропробирки. Осадок старались не взаимодействие с РНК.

Pages:     || 2 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.