WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 6 | 7 || 9 | 10 |   ...   | 83 |

Инулиназа как объект нанобиотехнологических исследований Холявка Марина Геннадьена (Воронежский государственный университет, Биолого-почвенный факультет, Россия, Воронеж, holyavka@rambler.ru) В последние годы при усовершенствовании многих технологических процессов в пищевой и фармацевтической промышленности широко используются гидролитические ферменты в свободном и иммобилизованном состояниях. Одним из перспективных продуктов функционального питания является фруктоза, которая в настоящее время превратилась в популярный заменитель сахара. Фруктозу, в отличие от глюкозы, могут потреблять больные диабетом, она значительно менее вредна для зубов, чем сахар.

Промышленное получение 95 % фруктозного сиропа может быть основано на применении иммобилизованной инулиназы (КФ 3.2.1.7). Иммобилизация – один из методов повышения стабильности ферментов к денатурирующим факторам, способствующий многократному использованию биокатализаторов, поэтому получение гетерогенных препаратов на основе иммобилизованных ферментов становится неотъемлемой частью современной нанобиотехнологической отрасли.

С целью получения стабильных и высокоактивных биокатализаторов для промышленного производства фруктозных сиропов нами была осуществлена иммобилизация инулиназы, выделенной из Kluyveromyces marxianus Y-303 различными методами на синтетических полимерных носителях. Показано, что наибольшую каталитическую активность проявляет фермент, адсорбированный на макропористой анионообменной смоле АВ-17-2П.

Очевидно, что разработка эффективных биокатализаторов на основе энзимов невозможна без детального изучения их структуры. В связи с этим для изучения надмолекулярной организации инулиназы из Kluyveromyces marxianus нами был использован комплексный подход, заключающийся в сочетании атомно-силовой микроскопии с методами инфракрасной спектроскопии, гель-хроматографии и электрофореза. Установлено, что инулиназа имеет олигомерную структуру, которая представлена двумя субъединицами, различающимися по размерам, молекулярной массе и каталитической активности. Показано, что при разделении димера, массой 63 кДа, на мономеры происходит увеличение числа нерегулярных участков, по сравнению с нативным ферментом, на 6 % для субъединицы № (54,8 кДа) и на 10 % для субъединицы № 2 (8,4 кДа). Каталитическая активность отдельных мономеров инулиназы значительно ниже активности димера, что указывает на важный вклад надмолекулярной организации и диссоциации-ассоциации субъединиц в процесс регуляции механизмов реакции гидролиза полисахаридов.

Влияние гидратированных фуллеренов С60 на активность ферментов Яблонская Ольга Игоревна, Воейков В.Л.

(Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, Россия, Москва, olga.yablonsky@gmail.com) Установлено, что гидратированные фуллерены С60 (HyFn) в концентрациях меньших чем 10-13 M стабилизируют пероксидазу, щелочную фосфатазу и бактериальную люциферазу, а также оказывают влияние на величины разброса данных и стандартного отклонения при определении активности ферментов в параллельных образцах. Существует гипотеза, согласно которой фуллерены, растворенные в воде по особой методике, образуют вокруг себя сферические водные кластеры динамически организованной воды. Физические и химические характеристики воды в кластере отличаются от объемной воды. Учитывая низкие концентрации фуллеренов в образцах, эффект гидратированных фуллеренов невозможно объяснить прямым влиянием фуллеренов на ферменты. Высказано предположение, что С60 образуют водные динамические кластеры, представляющие собой особые антиоксидантные среды, способные модулировать и регулировать протекание окислительно-восстановительных и свободнорадикальных процессов, к которым ферменты проявляют значительную чувствительность. В пользу этого предположения свидетельствует изменение кинетики ферментативных процессов в реакционных сосудах в присутствии пластинок полимера нафиона, характеризующегося способностью образовывать широкий слой динамически организованной воды, обладающей особыми окислительновосстановительными свойствами.

В рамках данной работы было изучено влияние гидратированных фуллеренов в широком диапазоне концентраций на 3 ферментные тест-системы. Были продемонстрированы стабилизирующие свойства HyFn на изученные ферменты при длительном хранении и после термической инактивации. В доказательство предположения, что влияние гидратированных фуллеренов опосредовано водной средой реакции, получены данные о влиянии пластинок «нафиона» на активность пероксидазы и щелочной фосфатазы.

Atomic force microscopy study of cell rearrangements and cell surface during Xenopus laevis embryo development.

Efremov Yuri, Pukhlyakova E.

(Moscow State University, Faculty of Biology, Russia, yu.efremov@gmail.com, ekaterina24_87@mail.ru) Atomic force microscopy (AFM) has become a powerful tool for imaging biological structures from single molecules to living cells and carrying out force measurements. AFM provides threedimensional high-resolution images of the studied biological objects in physiological environment.

Xenopus laevis embryos at different stages of development were studied with AFM. During the experiments the embryos were tightly fixed in the holes of the agarose substrate and imaged in contact mode in buffer solution or cultivation medium.

We have received AFM images of different poles of embryos at various stages of developmental. AFM data were compared with the results obtained with scanning electron microscopy (SEM). AFM investigation of fixed embryos allows us to obtain data similar to SEM, but it does not require complex sample preparation and treatment. Moreover, we have shown that AFM can be applied to study live embryos and visualize cell movements on the embryo surface in vivo. Thus the changes of quantity and distribution of microvilli on cell surface and the cytoskeleton remodeling can be observed.

We have shown that AFM is a powerful and convenient tool to study both fixed and living cells, tissues and developmental organisms. Our findings allow us to recommend АFМ to study embryo growth and development and the influence of various drugs/bioactive compounds on these processes.

СТЕНДОВЫЕ ДОКЛАДЫ Изучение продольного профиля рН вакуолярного сока в клетках Chara corallina методом внутриклеточной перфузии Алова Анна Владимировна (Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, кафедра биофизики, Россия, Москва, annaalova@gmail.com) На свету клетки харовых водорослей формируют чередующиеся зоны, которые отличаются по свойствам плазматической мембраны, а также по свойствам периферического слоя хлоропластов. Неоднородные профили рН в апопласте скоординированы с профилями флуоресценции и активности фотосинтеза. Природа тесной взаимосвязи между фотосинтетической активностью хлоропластов и мембранными процессами остается не раскрытой. Существуют предположения, что эта связь опосредована изменениями ионного состава цитоплазмы, в частности изменениями активности ионов H+ и Ca2+. В нашей работе с помощью метода фиксации напряжения показано, что кинетика потенциалозависимых ионных токов через плазматическую мембрану зависит от условий освещения. Инактивация Сl– тока, индуцированного коротким импульсом деполяризации, происходила быстрее в темноте, чем на свету. Это может быть обусловлено рН-зависимым изменением уровня Са2+ в цитоплазме, который открывает Сl– каналы.

При изучении взаимосвязи между работой плазматической мембраны и хлоропластов представляется перспективным использование такой модельной системы как перфузируемая клетка. Этот метод позволяет устранить тонопласт и получить непосредственный доступ к слою хлоропластов, которые остаются фиксированными в непосредственной близости от плазмалеммы. В ходе проведения перфузии регистрировали изменения рН и параметров флуоресценции хлоропластов. В качестве дополнительного показателя, отмечающего замену вакуолярного сока на искусственную среду, измеряли флуоресценцию флуоресцеина, добавленного в перфузионный раствор. Измерения рН вакуолярного сока, протекающего через клетку в процессе перфузии, позволяют оценить время перфузии, распределение вакуолярного рН по длине клетки, выявить момент разрушения тонопласта. При перфузии раствором с низким содержанием Са2+ уровень флуоресценции остается высоким, хлоропласты сохраняют реакцию на свет и способность к нефотохимическому тушению.

При промывке клеток раствором с высокой концентрацией Са2+ уровень флуоресценции уменьшается. Сделан вывод, что изменения [Ca2+] в цитоплазме могут регулировать активность фотосинтеза.

Антиоксидантный эффект ксантозина in vitro и in vivo.

Асадуллина Нелли Рустамовна, Гудков С.В.

(Учреждение российской академии наук институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Россия, Пущино, micronelly@rambler.ru) Активные формы кислорода (АФК) постоянно образуются в аэробных клетках в процессе нормального метаболизма, а так же при воздействии факторов среды (ионизирующее излучение, тепло и др.). Увеличение внутриклеточной концентрации АФК свыше уровня антиоксидантной защиты вызывает «окислительный стресс», приводящий к необратимым повреждениям и гибели организма. Поэтому поиск и изучение новых природных антиоксидантов является актуальной задачей. Целью данной работы было изучение с помощью различных тест-систем антиоксидантных свойств ксантозина.

С помощью метода усиленной хемилюминесценции и специфической флуоресцентной ловушки для гидроксильных радикалов кумарин-3-карбоновой кислоты, исследовано влияние ксантозина в диапазоне концентраций 0,02-1 мМ на генерацию перекиси водорода и гидроксильных радикалов в водном растворе при воздействии рентгеновского излучения в дозах 1-7 Гр. Установлено, что количество образовавшихся АФК линейно зависит от поглощенной дозы, а ксантозин уменьшает количество перекиси водорода и гидроксильных радикалов, генерируемых рентгеновским излучением в водных растворах в несколько раз.

Используя иммуноферментный анализ, с применением специфических в 8-оксогуанину (8ОГ) антител, исследовано влияние ИМФ в диапазоне доз 0,02-1 мМ на образование в ДНК in vitro 8-ОГ-биомаркера окислительного повреждения, при воздействии рентгеновского излучения в дозах 1-7 Гр. Методом собственной люминесценции белковых растворов показано, что ксантозин эффективно элиминируют in vitro долгоживущие белковые радикалы бычьего сывороточного альбумина индуцированные рентгеновским излучением.

При внутрибрюшинном введении ксантозина (45 мкг/г) самцам мышей Kv:SHK за 15 минут перед облучением наблюдается некоторое увеличение выживаемости, а при введении за минут после облучения наблюдается значительное увеличение выживаемости опытных животных. Таким образом, в данной работе показано, что ксантозин проявляет существенный антиоксидантный эффект in vitro и in vivo.

Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (1004-00949-а; 10-04-00800-а) и Президента Российской Федерации для поддержки молодых российских ученых (МК-108.2010.4).

Исследование связывания комплекса блокатора калиевых каналов с квантовыми точками в изолированном нейроне Березуцкая Мария Александровна (Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, Россия, Москва, berezutskaya@hotmail.com) В настоящее время одним из актуальных направлений в современной биологии является определение структуры и функций мембранных и мембранно-связанных белков. В связи с низким уровнем биосинтеза многих мембранных белков в биологических тканях основным источником этих белков для структурно-функциональных исследований являются рекомбинантные белки. Для проверки правильности укладки полипептидной цепи целевого белка в мембране используют тесты, связанные с изменением функциональной активности белка, а также способностью связывать лиганды[3].

В данной работе рассматривали новый метод определения правильности фолдинга калиевых каналов, используя комплекс агитоксина(AGTx) с квантовыми точками CdTe.

Известно, что агитоксин эффективно блокирует калиевые каналы, в то время как действие комплекса агитоксина с квантовыми точками не было изучено. Работу комплекса изучали на калиевых каналах изолированного нейрона пиявки Hirudo medicinalis.

Определение связывания комплекса агитоксина(AGTx) и квантовых точек CdTe с калиевым каналом проводили с помощью флуоресцентной микроскопии. Основное преимущество квантовых точек CdTe перед органическими красителями состоит в высокой фотостойкости, возможности направленного регулирования длины волны флуоресценции, высоких квантовых выходах. Для проверки эффективности работы комплекса блокатора с квантовыми точками добавляли 4-аминопиридин(4-АП), который также является блокатором калиевых каналов. После добавления 4-АП большей концентрации происходит вытеснение комплекса CdTe c AGTx с поверхности калиевых каналов. Поскольку в 4-АП не добавляли флуоресцентные зонды, то флуоресценция нейрона заметно уменьшалась, это свидетельствует о том, что комплекс агитоксина с квантовыми точками является эффективным блокатором калиевых каналов.

В результате проведенного исследования было показано, что комплекс агитоксина с квантовыми точками CdTe эффективно работает и его можно применять при определении правильности фолдинга калиевых каналов.

Pages:     | 1 |   ...   | 6 | 7 || 9 | 10 |   ...   | 83 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.