WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 83 |

Особенности аллостерической регуляции тромбина Озеров Иван Витальевич1,2, Ефремов Р. Г.(1Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, Биологический факультет, 2Институт биоорганической химии РАН им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, Москва, Россия, varnivey@mail.ru) Растворимый белок плазмы крови тромбин относится к классу сериновых протеаз и играет ключевую роль в процессе свёртывания крови. Помимо основного активного центра тромбин имеет три дополнительных аллостерических сайта. Связывание различных соединений в этих сайтах определяет конформационные переходы между формами тромбина, выполняющими различные физиологические функции.

В настоящее время методы компьютерного молекулярного моделирования стали неотъемлемой частью фундаментальных исследований, направленных на изучение молекулярных механизмов функционирования белков. Для изучения конформационной подвижности тромбина нами был использован метод молекулярной динамики.

В процессе работы были проанализированы особенности внутримолекулярных движений тромбина, найдены корреляции между движениями различных частей молекулы.

Показаны структурные различия между двумя наиболее изученными формами тромбина, которые отличаются по своей физиологической роли: первая «прокоагулянтная» форма превращает растворимый белок плазмы фибриноген в нерастворимый фибрин, из которого и строятся тромбы, в то время как вторая «антикоагулянтная» форма тромбина расщепляет протеин С, переводя его в активную форму, что наоборот приводит к замедлению тромбообразования. Показаны изменения подвижности важных аминокислотных остатков активного сайта, определяющих специфичность тромбина к различным субстратам, при переходе между формами.

Применение прямых ингибиторов активного сайта тромбина в качестве антикоагулянтов вызывает целый ряд побочных эффектов и далеко не всегда приводит к ожидаемому терапевтическому эффекту. В отличие от ингибиторов активного сайта аллостерические регуляторы лишь модулируют активность тромбина, не внося выраженного дисбаланса в систему свёртывания крови. Но для эффективного поиска новых аллостеричеких регуляторов, которые являются потенциальными лекарствами, чрезвычайно важно установить связь между структурными изменениями и функцией тромбина. Пониманию и анализу этой связи посвящена данная работа.

Моделирование информационной структуры цитохрома с на его ADD- сайте при помощи АНИС-метода Островерхова Татьяна Владимировна 1,2, Черткова Р.В.2, Некрасов А.Н.(1Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, 2Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, Москва, Россия, tato-tato@list.ru) В соответствии с данными АНИС-метода предложена модель функционирования цитохрома с, основанная на подвижности структурных блоков, соответствующих ЭЛИС высшего ранга. Для проверки модели было предложено понизить конформационную подвижность ADD-сайта, на котором расположен Мет-80, являющийся лигандом Fe гема цитохрома с. Мутантные гены цитохрома с синтезировали методом сайт-направленного мутагенеза QuikChangeTMMutagenesisKit (Stratagene, США).

С использованием ряда аминокислотных остатков, имеющих наибольшую частоту встречаемости в ADD+ сайтах негомологичных белков и протеома E.coli, составлен массив фрагментов 76-83 а.о. цитохрома с. При помощи АНИС-метода рассчитаны информационные структуры первичных последовательностей цитохрома с, включающих полученные фрагменты. Компьютерное моделирование ADD- сайта позволило предложить замены а.о. на этом участке, изменяющие его конформационные свойства. Результаты анализа предлагаемых мутантных вариантов цитохрома с распределены в три группы.

Первая группа мутантных вариантов содержит ADD+ сайт с равномерно распределённой плотностью ЭЛИС по фрагменту 76-83 а.о. цитохрома с. Вторая и третья группы содержат ADD+ сайт с плотностью ЭЛИС, смещённой от Met-80 либо к N-концевой, либо к Cконцевой последовательностям цитохрома с, соответственно. Были получены мутантные гены P76R/G77I/T78L/K79V/I81V/F82S/A83R и P76R/G77R/T78E/I81S/F82A/A83I, относящиеся к третьей группе мутантных последовательностей. Конформационные изменения, возникающие при подвижности структурных блоков цитохрома с, локализованы на единственном в структуре белка сайте 76-83 а.о. пониженной плотности ЭЛИС первого ранга (ADD- сайте), где расположен остаток Мет-80, взаимодействующий с атомом Fe гема, обеспечивающего электрон-транспортную активность цитохрома с. Для понижения конформационной подвижности ADD- сайта проведено моделирование информационной структуры цитохрома с на участке 76-83 а.о. Сконструирован ряд мутантных вариантов цитохрома с, включающих cайт повышенной плотности ЭЛИС на участке 76-83 а.о. белка.

Полученые мутантные гены отвечают заданной информационной структуре цитохрома с.

Изучение функциональной зависимости между фотосистемами в ходе синхронного измерения индукции быстрой и замедленной флуоресценции и показателя A820 у зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii Патрин Максим Михайлович (Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, Россия, Москва, octomax5@gmail.com) В настоящее время актуальным является одновременное изучение процессов внутри фотосистемы II (ФCII) и фотосистемы I (ФСI). JIP-тест является наиболее информативным методом изучения событий в донорной части ЭТЦ, с другой стороны кинетику окислительно-восстановительных процессов в ФСI оценивают по изменению поглощения света при 820 нм (А820). Для одновременной регистрации кинетики быстрой и замедленной флуоресценции реакционного центра ФСII и кинетики окислительно-восстановительного потенциала реакционного центра ФСI (P700) у зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii использовали мультифункциональный анализатор эффективности растений M-PEA (Hansatech, UK). В качестве объекта исследований использовали культуру Chlamydomonas reinhardtii Dang. Функциональная зависимость между фотосистемами оценивалась экспериментально при различных внешних условиях: интенсивность действующего света;

наличие ингибиторов (DCMU и гидроксиламин); выращивание на среде без содержания сульфатов.

Ингибиторный анализ в условиях насыщающей интенсивности света (5000 мкЕ) позволил предположить активацию компенсаторных путей электронного транспорта между фотосистемами. Диурон и гидроксиламин оказывают ингибирующие воздействие на донорную часть ЭТЦ, не затрагивая акцепторной части, т.е. ФСI, что можно наблюдать по показателю А820. Наиболее выраженное ингибирование наблюдается при росте культуры условиях «серного голодания», когда не наблюдается реокисления P700-. Дополнительное введение диурона в таких условиях вызывает быстрое накопление P700+. Описанная кинетическая модель учитывает функциональную зависимость между фотосистемами на основании данных о степени окисления реакционных центров фотосистем в различном временном диапазоне.

Синхронный анализ нескольких сигналов позволяет проводить комплексную оценку состояния фотосинтетической активности. Этот подход является дополнительным к другим методам исследованиям и позволяет получить количественные и качественные данные о взаимосвязи комплексов фотосистем. Написанная на основании экспериментальных данных модель может быть использована для задач экологического мониторинга.

Исследование кислородного статуса экспериментальных опухолей с использованием метода оптической диффузионной спектроскопии Пряникова Татьяна Игоревна (Нижегородский государственный университет им. Лобачевского, Россия, Нижний Новгород, tipryanikova@mail.ru) Кислородный статус опухоли рассматривается в настоящее время как один из ключевых факторов, определяющих прогноз заболевания и эффективность лечебных воздействий. В настоящей работе для оценки оксигенации опухоли предлагается метод оптической диффузионной спектроскопии (ОДС). Данный метод позволяет определять концентрацию окисленного (HbO2) и восстановленного (HHb) гемоглобина в тканях и, соответственно, оценивать степень насыщения крови кислородом – параметр, отражающий кислородный статус опухоли. Целью исследования было определение возможностей метода ОДС для определения и мониторинга оксигенации экспериментальных опухолей в ходе естественного роста и ответа на терапевтическое воздействие. Эксперименты проводились с использованием двух опухолевых моделей: лимфосаркомы Плисса (ЛСП) и рака молочной железы крыс (РМК-1), различающиеся по своему гистологическому строению и ростовым характеристикам. По ОДС-данным рассчитывали двумерное распределение концентраций основных тканевых хромофоров в зоне опухоли, а так же уровень насыщения крови кислородом. Для верификации результатов использовали метод иммуногистохимического анализа с экзогенным маркером гипоксии пимонидазолом. С целью определения возможностей метода ОДС для оценки изменений кислородного статуса опухоли была проведена серия экспериментов с использованием агента, повышающего микроциркуляторную перфузию – пентоксифиллина. Как показали проведенные эксперименты, модель ЛСП характеризуется повышенной концентрацией HHb и сниженным содержанием HbO2 и уровня насыщения крови кислородом по сравнению с окружающими нормальными тканями. Для модели РМК-1 было продемонстрировано снижение концентрации HbO2 в проекции опухолевого узла; при этом содержание HHb данного соединения в опухоли практически не отличалось от нормы. При действии пентоксифиллина наблюдалось снижение концентрации HHb (до уровня окружающих здоровых тканей) и повышение содержания HbO2. Таким образом, метод ОДС позволяет не только детектировать экспериментальные опухоли и получать информацию об уровне насыщения крови кислородом, но и изучать динамику уровня кислородного статуса опухолей.

Влияние соотношения липидов с различными типами полярных головок на свойства бислоя Тарасова Наталия Константиновна1, Пыркова Д.В.2, Ефремов Р.Г.(1Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, 2Институт биоорганической химии им. академиков М.М.

Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Россия, Москва, nktarasova@gmail.com) Мембраны большинства клеток в основном состоят из липидов. Изменение соотношения между различными типами липидов может быть одним из механизмов реализации клеточной мембраной своих функций. Целью данной работы было исследование влияния соотношения липидов с цвиттерионным (диолеилфосфатидилхолин, ДОФХ) и заряженным (диолеилфосфатидилсерин, ДОФС) головками на структурно-динамические свойства бислоя.

При помощи метода молекулярной динамики (МД) было исследовано 9 модельных гидратированных бислоев из ДОФХ и ДОФС в разных процентных соотношениях. Расчеты МД (~15 нс) были проведены в тяжело-атомном представлении при температуре 325 К с использованием программного пакета GROMACS v3.3.1.

Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы. Общие свойства бислоя (геометрические параметры, параметры порядка ацильных цепей липидов и т.д.) меняются линейно в зависимости от концентрации липидов и не отражают наличие особенностей в исследуемых системах. Однако при более детальном изучении были выявлены следующие интересные закономерности, преимущественно при низких концентрацях ДОФС (соответствующих физиологическим). Взаимодействие ионов Na+ в основном происходит с ацильными цепями молекул ДОФХ. Число контактов между ними максимально при 30% ДОФС в бислое. При этой же концентрации ДОФС полярная головка данного липида имеет наибольший угол наклона по отношению к нормали к бислою, а головка ДОФХ, напротив, наименьший. Кроме того, при низких концентрациях (до 30%) ДОФС происходит перекрывание ацильных цепей ДОФС из противоположных монослоев в центре бислоя, из чего можно сделать предположение о наличии «матрицы», создаваемой ДОФХ, в которую встраиваются молекулы ДОФС.

Таким образом, в изучаемых бислоях с различным соотношением ДОФС и ДОФХ было показано наличие необычной структуры и свойств при назком содержании ДОФС (менее 30%).

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ и программ РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Основы фундаментальных исследований нанотехнологий и наноматериалов».

Сравнительное исследование свойств мембранносвязанного и цитоплазматического гемоглобина в эритроцитах методами спектроскопий комбинационного и гигантского комбинационного рассеяния Хабатова Венера Владимировна (Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, Россия, Москва, venera_khabatova@mail.ru) Свойства плазматической мембраны и мембранных белков в эритроцитах меняются на ранних стадиях заболеваний сердечно-сосудистой системы. Такие модификации влияют на конформацию мембранносвязанного гемоглобина, взаимодействующего с цитоплазматическим участком трансмембранного белка.

В нашем исследовании изучаются свойства двух субпопуляций гемоглобина в эритроцитах: цитозольного и мембранносвязанного с помощью спектроскопий комбинационного (КР) и гигантского комбинационного (ГКР) рассеяния. ГКР регистрирует сигнал “поверхностно усиленного” КР, получаемого при использовании наночастиц (НЧ) благородных металлов. В нашей работе НЧ адсорбировали на мембране эритроцита.

Возникающий поверхностный плазмонный резонанс на НЧ усиливает комбинационное рассеяние молекул, находящихся на расстоянии не более 15-20 нм от поверхности НЧ.

Толщина мембраны клетки составляет около 10 нм. Оставшиеся 10 нм примембранной области содержит фракцию мембранносвязанного гемоглобина.

В работе исследовали изменение свойств цитоплазматического и мембранносвязанного гемоглобина при влиянии различных факторов окружения: показателя кислотности среды (варьировался в диапазоне 5 - 9,5 pH); жесткости плазматической мембраны, изменяющейся при встраивании или экстракции холестерина. Также проводилось КР-картирование эритроцита, на поверхности которого адсорбированы НЧ серебра и их агрегаты. Также были проведены in vivo эксперименты по КР-картированию сосудов участка головного мозга лабораторной мыши.

В результате исследования получено: цитоплазматический и мембранносвязанный гемоглобин имеют разную чувствительность к изменению кислотности среды в клетке, а также к изменению содержания холестерина в плазматической мембране. КР-картирование эритроцита с НЧ серебра на поверхности выявило возможность пространственно разделить КР-сигнал от цитозольного и ГКР-сигнал от мембранносвязанного гемоглобина. В результате КР-картирования in vivo сосудов мозга мыши было показано, что в сосуде локально меняется концентрация оксигенированного и дезоксигенированного гемоглобина.

Автор выражает искреннюю благодарность научным руководителям Браже Н.А., Браже А.Р., а также профессору Максимову Г.В. и сотрудникам лаборатории Паршиной Е.Ю. и Юсиповичу А.И. за помощь, советы и поддержку, оказанные в ходе выполнения данной работы.

Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 83 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.