WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 48 | 49 || 51 | 52 |   ...   | 83 |

Физико-химический анализ конформационных особенностей изолированного из клеточных стенок белка Bgl2p в сочетании с иммуно-флуоресцентной и электронной микроскопией показал, что данный фермент способен формировать фибриллярные структуры амилоидного типа, которые могут играть структурную функцию в клеточной стенке. Обнаружение в составе клеточных стенок дрожжей белка, обладающего такими свойствами, помимо несомненного научного интереса имеет и практическую значимость, поскольку позволяет прогнозировать нежелательные побочные эффекты при использовании дрожжей в фармакологической и пищевой промышленности.

Работа поддержана грантом РФФИ 10-04-01821-а. Автор благодарит своих научных руководителей чл.-корр. РАН Кулаева И.С. и профессора д.б.н. Калебину Т.С. за всестороннюю поддержку и научное руководство.

Колокализация протоонкогенов на поверхности ядрышка как следствие ингибирования ДНК-топоизомеразы II Рубцов Михаил Александрович1, Разин С.В.1,2, Яровая О.В.( Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, 2Институт биологии гена РАН, Россия, Москва, ma_rubtsov@mail.ru) Гены AML1 и ETO человека являются известным генами-партнерами по хромосомной транслокации t(8,21), ассоциированной с развитием так называемых «обусловленных лечением» (treatment-related) или «вторичных» лейкозов у пациентов, перенесших химиотерапию с применением ингибиторов ДНК-топоизомеразы II (топоизомеразных ядов).

Для лучшего понимания механизмов образования транслокации t(8,21) мы проанализировали взаимную пространственную локализацию генов AML1 и ETO в трехмерном пространстве ядра с использованием культуры клеток человека лимфоидной природы (линия Jurkat). Проведя трехмерную флуоресцентную гибридизацию in situ (3D FISH) с последующей реконструкцией и анализом трехмерных изображений мы показали, что в случае контрольных клеток аллели AML1 и ETO находятся в непосредственной пространственной близости друг от друга с 5%-ой вероятностью. В то время как в клетках, обработанных ингибитором ДНК-топоизомеразы II этопозидом, вероятность колокализации генов AML1 и ETO увеличивается в два раза. Причем более чем в половине случаев колокализация флуоресцентных сигналов, соответствующих генам AML1 и ETO, наблюдается на поверхности ядрышка. Возможная роль ядрышка в сближении концов двухцепочечных разрывов ДНК пока не ясна, хотя результаты более ранних экспериментов свидетельствуют об участии этого многофункционального ядерного компартмента в репарации ДНК.

Кроме того мы показали, что обработка клеток Jurkat этопозидом вызывает увеличение связывания белка Rad51 с кластерами точек разрыва (breakpoint cluster regions, bcr) внутри генов AML1 и ETO. Полученные результаты свидетельствуют о том, что репарация повреждений, вносимых в ДНК топоизомеразными ядами, может осуществляться посредством нескольких механизмов, что, в свою очередь, может обуславливать возникновение ошибок, приводящих к хромосомным транслокациям.

Работа выполнена при частичном финансировании из средств ГК П(Министерство образования и науки Российской Федерации), грантов 10-04-00305-а и 0904-93105-НЦНИЛ_а (РФФИ), гранта компании Carl Zeiss и Гранта Президента РФ (МК222.2011.4).

Получение, кристаллизация и определение структуры полноразмерного L1-выступа бактериальных рибосом Сарских Алена Витальевна, Костарева О.С., Михайлина А.О., Никонова Е.Ю.

(Учреждение Российской академии наук Институт белка РАН, Россия, Пущино, carckih@rambler.ru) L1-выступ рибосомы участвует в высвобождении деацилированной тРНК из Е-сайта. Он образован рибосомным белком L1 и специфическим фрагментом 23S рРНК. Из-за высокой подвижности L1-выступа его структуру в течение длительного времени не удавалось определить в составе интактных рибосомных частиц. В моделях рибосом использовалась полученная ранее в нашей лаборатории структура гибридного комплекса, образованного архейным белком L1 и укороченным фрагментом бактериальной рРНК длиной нуклеотидов из Thermus thermophilus, содержащим спирали 76 и 77. Белок L1 является также белком-регулятором, он связывается со специфическим участком на мРНК и осуществляет регуляцию собственного синтеза и синтеза белков, находящихся в том же опероне, по принципу «обратной связи». Для того чтобы определить принципы регуляции синтеза рибосомных белков, необходим детальный сравнительный структурный анализ рибосомного и регуляторного комплексов белков-регуляторов. Ранее в нашей лаборатории была определена структура комплекса бактериального белка L1 из T. thermophilus (TthL1) со специфическим фрагментом мРНК с разрешением 2.1.

Целью нашей работы является уточнение структуры полноразмерного L1-выступа бактериальной рибосомы с высоким разрешением и детальный сравнительный анализ взаимодействий белка TthL1 cо специфическими фрагментами мРНК и рРНК. Для получения полного фрагмента бактериальной рРНК мы клонировали ген фрагмента 23S рРНК длиной 80 нуклеотидов, содержащий спирали 76, 77 и 78. Данный фрагмент рРНК был наработан транскрипцией in vitro c использованием T7 РНК-полимеразы и очищен методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Мы получили кристаллы гомологического бактериального комплекса белка TthL1 с таким длинным фрагментом рРНК, которые успешно использовались для сбора дифракционных данных. Структура комплекса была определена методом молекулярного замещения с высоким разрешением - 2. Показано наличие дополнительных водородных связей, образованных нуклеотидами 78 спирали 23S рРНК и аминокислотными остатками спирали TthL1, которая присутствует лишь у белка L1 из бактерий.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (№ 10-04-00618) и Программы МКБ РАН.

Экспрессия генов субъединицы В сукцинатдегидрогеназы в прорастающих семенах кукурузы Селиванова Наталия Владимировна, Федорин Д.Н., Ву Л.Т., Махмуд А.С.

(Воронежский госуниверситет, Биолого-почвенный факультет, Россия, Воронеж, kir2202@yandex.ru) Сукцинатдегидрогеназа (СДГ, КФ 1.3.99.1) является важнейшим регулятором метаболических путей, поэтому вопрос ее функционирования детально исследуется.

Генетическая детерминация СДГ в геномах высших растений характеризуется наличием полигенного семейства. Ранее нами было показано, что экспрессия генов субъединицы А СДГ в проростках кукурузы неоднородна, в связи с этим, целью данной работы явилось изучение экспрессии генов, кодирующих субъединицу В сукцинатдегидрогеназы.

В качестве объектов исследования использовали семена кукурузы Zea mays L. сорта Воронежская 76. Полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводили на приборе Bio-Rad Chromo 4 (Bio-Rad, США), используя в качестве красителя SYBR Green I, расчет уровня экспрессии проводили по методу 2-Ct.

Показано, что уровень транскрипции генов sdh2-1, sdh2-2 и sdh2-3 изменяется по мере развития проростка. Установлено, что ген sdh2-3 активно экспрессируется в течение всего периода прорастания семян, тогда как гены sdh2-1 и sdh2-2 интенсивно транскрибируются только в сухих семенах. Профили экспрессии генов sdh2-1 и sdh2-2 имеют сходное проявление с генами ферментов, вовлеченных в глюконеогенез, что позволяет предположить роль генов sdh2-1 и sdh2-2 в организации метаболической программы, позволяющей мобилизовать запасные вещества. Однако установлено, что ген sdh2-3 активно экспрессируется в течение всего периода прорастания семян. Вероятно, продукт данного гена принимает участие в энергетическом метаболизме клетки на уровне ЦТК и ЭТЦ митохондрий. Полученные результаты позволяют предположить, что при прорастании комплекс II, содержащий в своем составе субъединицу В, кодируемую генами sdh2-1 или sdh2-2, постепенно замещается на комплекс II, который включает субъединицу гена sdh2-3, обеспечивающего высокую скорость функционирования дыхания на ранних стадиях развития семян.

Таким образом, обнаружена дифференциальная экспрессия генов субъединицы В СДГ при прорастании семян, обусловленная полифункциональностью исследуемой ферментной системы, которая обеспечивает протекание различных метаболических процессов в онтогенезе растений.

Экспрессия гена CTCF кур в клетках млекопитающих Сорокина Ирина Владимировна, Котова Е.С., Акопов С.Б., Николаев Л.Г.

(Институт Биоорганической Химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.

Овчинникова РАН, Россия, Москва, atem2610@mail.ru) Белок CTCF – многофункциональный, высоко консервативный транскрипционный фактор позвоночных. Благодаря способности взаимодействовать с разнообразными регуляторными элементами генома, он представляет большой интерес для исследователей.

При получении белков позвоночных в клетках прокариот и беспозвоночных существует вероятность неправильной укладки полипептидной цепи и отсутствия характерных для них посттрансляционных модификаций.

Мы ставили своей целью разработать простой и быстрый способ получения и очистки куриного CTCF синтезированного в клетках позвоночных.

С этой целью в вектор pHHc, предназначенный для суперэкспрессии гена куриного CTCF в клетках млекопитающих, была введена последовательность, кодирующая гистидиновый таг, состоящий из шести аминокислотных остатков гистидина. Методом Вестерн-блот анализа клеточных лизатов проводилось сравнение количества белка CTCF в клетках, трансфицированных полученной конструкцией – pHHc-his – и интактных. Было показано, что в трансфицированных клетках синтезируется белок CTCF с гистидиновым тагом, количество которого значительно превосходит количество эндогенного CTCF.

Проводился функциональный анализ белка CTCF с гистидиновым тагом методом сдвига электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле. Было показано, что рекомбинантный белок способен специфически узнавать те же последовательности ДНК, что и нативный, а также что он локализуется в ядре. Была проведена очистка белка CTCF с гистидиновым тагом из клеточного лизата с помощью металлоафинной хроматографии на колонках с иммобилизованными ионами никеля, а затем – анионообменной хроматографии на Q-сефарозе.

Был получен белок CTCF с гистидиновым тагом в клетках Cos-1, трансфицированных конструкцией pHHc-his. Было показано специфическое узнавание им последовательностей ДНК in vitro и ядерная локализация этого белка. Получены фракции, обогащенные белком CTCF.

Взаимодействие фактора транскрипции TnrA с регуляторным белком GlnK и глутаминсинтетазой Федорова Ксения Павловна 1, Каюмов А.Р.1,(1Казанский (Приволжский) федеральный университет, 2Казанский государственный архитектурно-строительный университет, Россия, Казань, ksunchik-@mail.ru) В клетках Bacillus subtilis фактор транскрипции TnrA контролирует экспрессию множества генов в условиях недостатка источника азота и в активном состоянии связан с мембраной посредством белков GlnK-AmtB. Белок TnrA имеет два функциональных домена:

N-концевой домен необходим для связывания с ДНК, а для С-концевого домена показано взаимодействие с глутаминсинтетазой (GS). Мы предположили, что С-конец также участвует во взаимодействии с белком GlnK. Целью работы было установить роль Сконцевого домена белка TnrA во взаимодействии с белками GlnK и GS.

На основе вектора pET15b были получены плазмиды для гиперпродукции белков TnrA с 6-гистидиновым тагом на N-конце и делециями С-конца на 6, 20 и 35 аминокислот (TnrA6, TnrA20, TnrA35) в клетках E.coli BL21. Плазмиды для гиперпродукции белков GlnK и GS со стреп-тагом были предоставлены проф. Форшхаммером, университет Тюбингена, Германия.

Белки TnrA, GlnK и GS были очищены до электрофоретической гомогенности.

Взаимодействие нативного и мутантных белков TnrA с GlnK и GS исследовали in vitro методом «pull down» на стреп-тактин сефарозе и Ni-NTA агарозе. Эксперименты показали, что делеция С-конца на 6 аминокислот делает невозможным связывание белка TnrA с GS. В то же время, лишь делеция 35 аминокислот приводила к отсутствию взаимодействия с белком GlnK. Вероятно, сайт взаимодействия с белком GlnK локализован между 20 и аминокислотами с С-конца фактора TnrA. Таким образом, С-конец фактора TnrA необходим для взаимодействия с GlnK и GS, сайты для связывания с этими белками расположены близко друг к другу, но не перекрываются. Вероятно, образование комплексов с регуляторными белками является механизмом контроля активности фактора TnrA.

Автор выражает признательность профессору, д.б.н. Ильинской О.Н. за помощь в проведении экспериментов и подготовке тезисов. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» (ГК 1275П от 09.06.2010).

1А2- и Wari-инсуляторы взаимодействуют с промоторами генов yellow и white D.

melanogaster Четверина Дарья Александровна (Учреждение Российской Академии Наук Институт Биологии гена РАН, Россия, Москва, dchetverina@yandex.ru) Инсуляторы – специализированные регуляторные элементы, участвующие в модуляции взаимодействий между энхансерами и промоторами. Несмотря на большое количество исследований, роль инсуляторов в регуляции транскрипции in vivo остается слабо изученной. Ранее было обнаружено, что непосредственно с 3'-стороны от генов yellow и white дрозофилы располагаются инсуляторы 1А2 и Wari, соответственно. В данной работе было протестировано наличие функциональных взаимодействий инсуляторов с промоторами генов-мишеней.

Способность инсуляторов взаимодействовать с промоторами генов была протестирована in vivo с использованием модельной трансгенной системы, основанной на неспособности GAL4-активатора дрожжей стимулировать транскрипцию на дальнем расстоянии.

В результате было показано, что 1A2- и Wari-инсуляторы способны взаимодействовать с промоторами генов yellow и white, соответственно, формируя «генные петли». Показано, что 5'-регуляторные области данных генов, необходимые для взаимодействия с энхансерами, не играют роли во взаимодействии с инсуляторами. Исследована специфичность взаимодействующих инсулятор-промоторных пар. Кроме того, делеция Wari-инсулятора за геном white приводит к значительному снижению транскрипции гена white, что свидетельствует о способности инсуляторов поддерживать базовый уровень транскрипции генов.

Мы предполагаем, что взаимодействие инсуляторов с промоторами генов играет важную роль в регуляции транскрипции.

Данное исследование было проведено при поддержке РФФИ (грант № 09-04-00903-а), гранта Президента РФ МК-3421.2011.4. Автор выражает благодарность академику Георгиеву П.Г. за руководство и помощь в проведении экспериментов.

Pages:     | 1 |   ...   | 48 | 49 || 51 | 52 |   ...   | 83 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.