WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 41 | 42 || 44 | 45 |   ...   | 83 |

Из водоемов Северо-Западного региона РФ в весенне-летний период 2010 г. были отобраны 37 проб, клеточный материал которых использовали для выделения «природной» тотальной ДНК. Затем был проведен молекулярно-генетический скрининг образцов ДНК с помощью метода ПЦР со специфичными праймерами. В частности, нами были отобраны праймеры к генам рcbC и petE трихомного представителя прохлорофитов Prochlorothrix hollandica, а также к генам psbA и rpoC одноклеточного Prochlorococcus sp. В дополнение были использованы видоспецифичные праймеры к гену 16S рДНК P. hollandica РСС 9006.

Проведенный нами молекулярно-генетический анализ выявил в семи водных пробах присутствие фрагментов ДНК сходных с ДНК трихомных прохлорофитов P. hollandica.

Таким образом, для выявления природного разнообразия прохлорофитов требуется применение комплексного подхода, который включает не только микроскопические, но и молекулярно-генетические методы исследования.

Детекция B. subtilis на основе моноклональных антител Сарина Нургуль Искаковна (РГП «Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан» КН МОН РК, Казахстан, Астана, nurgul-sarina@rambler.ru) Основными критериями оценки эффективности любой иммунологической реакции является изучение их чувствительности и специфичности по отношению к искомому антигену. Целью исследования являлось разработка сэндвич варианта точечного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием моноклональных антител (МКА), специфичных к белковым антигенам B. subtilis, один из которых конъюгирован с ферментом.

Для исследования были использованы образцы растворимых и корпускулярных антигенов B. subtilis и других родственных микроорганизмов в двукратных разведениях с убывающей концентрацией.

Результаты исследования показали, что в сэндвич варианте точечного ИФА с использованием специфичных МКА предел детекции растворимых белковых антигенов B.

subtilis 42 и B. subtilis 8 составил 0,005-0,002 мкг/мл. Минимальное количество выявляемых интактных клеток B. subtilis 8, B. subtilis 26, B. subtilis 43 и B. subtilis АТСС 6633 составила 1104 – 5103 м.к./мл.

Очень важно отметить специфичность сэндвич варианта точечного ИФА в отношении B.

cereus – наиболее близкородственного микроорганизма. Установлено, что испытуемый вариант ИФА детектировал B. cereus только при содержании 5108 м.к./мл. Остальные перекрестно реагирующие сапрофитные бациллы в виде цельных клеток B. firmus S-20, B.

termononliguafaciens ТР 1/1 DG-9, B. licheniformis 356, B. species 13/7, B. polymyxa 1459, B.

acidocoldarius БТ 90, B. thuringiensis subsp. terebrionis, B. anthracis СТИ-1, Escherichia coli, Salmonella dublin определенно в иммуноферментном анализе не выявлялись.

Результаты проведенных исследований дают основания предположить, что ИФА с использованием МКА обладает достаточной чувствительностью и специфичностью в отношении B. subtilis.

Пути метаболизма глифосата почвенными бактериями Ochrobactrum anthropi GPKи Achromobacter sp. MPS12A Свиридов Алексей Владимирович, Леонтьевский А.А.

(Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Россия, Пущино, alhummen@rambler.ru) В настоящее время остро встала проблема загрязнения почв глифосатом (ГФ) действующим компонентом распространенных гербицидов, обладающим токсикогенным и тератогенным потенциалом. ГФ устойчив к воздействию факторов среды, но расщепляется рядом микроорганизмов, что делает актуальной разработку технологий микробной ремедиации почв и стоков, загрязненных ГФ. Эта задача осложняется недостаточной изученностью путей минерализации ГФ и ферментов, эти пути образующих.

Основной целью работы было выявить и картировать пути метаболизма глифосата у двух штаммов почвенных бактерий с высокими показателями эффективности деструкции ГФ: Ochrobactrum anthropi GPK3 (ВКМ 2554 D) был выделен из почв, загрязненных ГФ, а Achromobacter sp. MPS12A из почв, загрязненных метилфосфоновой кислотой (МФК), и адаптирован к утилизации ГФ.

Разработанный нами метод жидкостной хроматографии амино- и фосфоновых кислот позволил установить, что расщепление ГФ штаммом GPK3 осуществлялось преимущественно ферментом глифосат-оксидоредуктазой с образованием аминометилфосфоновой кислоты (АМФК) и глиоксилата. АМФК затем подвергалась трансаминированию до фосфоноформальдегида, связь углерод-фосфор (С-Р) у которого атаковалась ферментом фосфоноацетальдегидгидролазой (фосфонатазой). Метаболизм ГФ штаммом MPS12A, напротив, шел с участием фермента С-Р лиазы, непосредственно расщеплявшего С-Р связь с образованием Pi и саркозина, превращавшегося затем в глицин под действием саркозиноксидазы.

Способность изученных штаммов полностью минерализовать ГФ без накопления в культуральной среде устойчивых интермедиатов позволяет использовать O. anthropi GPK3 и Achromobacter sp. MPS12A как основу для разработки новых технологий ремедиации почв, загрязненных глифосатом. Кроме того, картирование путей метаболизма ГФ дало возможность лучше понять механизмы адаптации бактерий к утилизации фосфонатов.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 09-04-00320.

Роль фактора транскрипции CodY в регуляции экспрессии гена металлопротеиназы Bacillus intermedius Сибгатуллина Эльвира Эмилевна (Казанский Приволжский Федеральный Университет, Биолого-почвенный факультет, Россия, Казань, elvira0510@rambler.ru) Одним из глобальных белков, участвующих в регуляции метаболизма и адаптации бактерий к неблагоприятным условиям, является фактор транскрипции CodY. Этот белок в клетках B. subtilis регулирует экспрессию около ста генов, которые вовлечены в ответ на голодание. CodY – это ГТФ-связывающий белок, который чувствителен к внутриклеточной концентрации ГТФ и регулирует транскрипцию генов в постэкспоненциальный период роста бактерий, позволяя клеткам адаптироваться к недостатку питательных средств.

Металлопротеиназы секретируются многими бациллами, хотя физиологическая роль многих из них до сих пор остается невыясненной. Представляло интерес изучить влияние различных регуляторных систем на экспрессию генов металлопротеиназ у бацилл. Работа посвящена установлению роли фактора транскрипции CodY на экспрессию гена внеклеточной металлоэндопептидазы mprBi в рекомбинантном штамме.

В промоторе гена металлопротеиназы mprBi идентифицированы потенциальные сайты регуляции для взаимодействия с белком CodY и сайты их расположения. Гомология узнаваемых CodY последовательностей составила 86% относительно консенсусной последовательности AATTTTCWGAAAATT. Эти результаты позволяют предположить участие регуляторного белка CodY в регуляции экспрессии гена металлопротеиназы на уровне транскрипции. Было показано, что максимум активности фермента в культуральной жидкости штамма B. subtilis (сodY, pSA1), дефектного по регуляторному белку CodY, наблюдается на 24-30-й час, что соответствует стационарной фазе роста культуры, однако уровень экспрессии гена металлопротеиназы оказался ниже в 1,5 раза относительно контроля B. subtilis (pSA1) в фазе вегетативного роста. Полученные данные позволили предположить участие регуляторного белка CodY в контроле экспрессии гена фермента металлопротеиназы в период вегетативного роста.

Действие Fe(II) и Fe(III) на биолюминесцентную активность рекомбинантного штамма Escherichia coli в остром опыте Сорокина Елена Владимировна (Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, Москва, Россия, sorokina_ev77@mail.ru) Для токсикологических и аналитических исследований используется метод биотестирования с помощью морских люминесцентных микроорганизмов. Эти биотесты отличаются большой пропускной способностью, дают количественную меру токсичности, чувствительны, просты, позволяют контролировать одновременно значительное число соединений. Для упрощения получения результатов были использованы рекомбинантные штаммы Е. coli со встроенными генами люминесцентной системы из морских бактерий.

Проведение эксперимента заключалось в добавлении к суспензии клеток Е. coli разных концентраций железа в диапазоне от 0,2 до 20 мг/л и изучение динамики ингибирования интенсивности свечения. Токсическое действие исследуемых веществ Fe(II) и Fe(III) определялось по снижению свечения тест-культуры за 30-минутный период экспозиции. По полученным результатам на люминометре Luminometer 1251 рассчитывали индекс токсичности опытных образцов.

Количественная оценка параметра выражается в виде величины - индекса токсичности:

Т= 100(Io-I)/Io, где Io и I - интенсивность свечения контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции. Для определения индекса токсичности проводили параллельное измерение контрольных (не содержащих токсических веществ) и опытных проб в трех повторностях. Методом экстраполяции были найдены величины ЕС20 и ЕС для Fe(II) и Fe(III), то есть те эффективные концентрации, при которых начинается достоверное влияние на бактериальную клетку, при этом токсичность составляет (20%) и концентрация, при которой уже имеет место острая токсичность (50% ингибирования свечения). ЕС20 и ЕС для Fe(II) составляет 2 мг/л и 10 мг/л соответственно. Для Fe(III) ЕС20 = 0,2 мг/л и ЕС 50 = мг/л. По результатом исследования видно, что железо влияет на свечение бактерий, снижая его в остром опыте, клетки E. coli более чувствительны к Fe(III), чем к Fe(II).

Следовательно, с помощью данного биотеста можно проводить скрининг токсичности веществ и давать рекомендации по предельно допустимой концентрации соединений, при которой не будет наблюдаться этот токсический эффект.

Морфологические изменения мицелия грибов Phytophthora и Fusarium под действием дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis Терпиловский Максим Александрович, Каменек Д. В.

(Ульяновский государственный университет, Экологический факультет, Россия, Ульяновск, maxim@terpilovsky.ru) Подвиды почвенной бактерии Bacillus thuringiensis продуцируют белковые дельтаэндотоксины, представляющие собой параспоральные кристаллы, способные оказывать антимикробное действие. Показано, что белковые токсины оказывают ингибирующее влияние на фитопатогенные грибы родов Bipolaris, Alternaria, Risoctonia, вызывающих многочисленные инфекционные заболевания растений. Использование этих метаболитов для борьбы с фитопатогенными грибами родов Phytophthora и Fusarium очень перспективно, однако, особенности действия токсинов малоизучены.

Для изучения действия дельта-эндотоксинов B. thuringiensis на морфологические особенности мицелия грибов Phytophthora infestans и Fusarium oxysporum последние инкубировали с токсином в течение 30 минут, 60 минут и 6 часов. Клетки инкубировали при 17 С (P. infestans) и 28 С (F. oxysporum) с препаратами токсина различной концентрации — 200 и 400 мкг/мл. Обработанный и подготовленный материал исследовали методами световой микроскопии.

Под действием дельта-эндотоксина B. thuringiensis в клетках грибов происходили патологические изменения. Отмечались значительное выделение секретируемых пузырьков, выраженная вакуолизация, изменение структуры цитоплазмы и гибель клеток. В контроле, где клетки инкубировались в отсутствие дельта-эндотоксина, каких-либо изменений в структуре клеток обнаружено не было.

Известно, что постоянные концентрации ионов и неэлектролитов в клетке поддерживают особые мембранные транспортные системы, важнейшим звеном которых являются АТФазы. Нарушения в работе этих систем влекут за собой вакуолизацию и лизис клеток. Существуют данные о том, что эндотоксины стимулируют активность Na+,K+АТФазы клеток. Степень активирования зависит от концентрации вводимого токсина.

Следствием деэнергизации является связанная с нарушением ионного транспорта и притоком в клетку воды вакуолизация, приводящая в конечном итоге к разрушению клетки.

Таким образом, в результате проведённых исследований удалось установить характер морфологических изменений, вызываемых дельта-эндотоксинами B. thuringiensis в клетках грибов P. infestans и F. oxysporum.

Работа проведена в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы.

Бактерии Paenibacillus ehimensis – источник циклодекстринглюканотрансфераз Федорова Полина Юрьевна (Институт биологии Уфимского научного центра РАН, Россия, Уфа, millinariya@yandex.ru) Циклодекстрины (ЦД) представляют собой макроциклические олигосахариды, получаемые ферментативным путем из крахмала. Источниками ферментов (циклодекстринглюканотрансфераз, ЦГТаз, К.Ф. 2.4.1.19), катализирующих образование ЦД, являются исключительно прокариоты, при этом системный поиск и выделение новых штаммов продуцентов является серьезной проблемой.

Впервые нами обнаружена способность продукции ЦД бактериями Paenibacillus ehimensis в группе из трех культур, включая типовую DSM 11029Т, депонированную в немецкой коллекции микроорганизмов, а также двух собственных изолятов: IB-739 и IBG2P. Для получения активной культуральной жидкости бактерии культивировали при 37С в 250-мл качалочных колбах в течение 68-72 ч на питательной среде следующего состава, г/л:

крахмал – 10,0; пептон – 4,0; дрожжевой экстракт – 5,0; K2HPO4 – 1,0; NaH2PO4 – 1,(рН=7,2). Биомассу отделяли центрифугированием, фильтрат КЖ концентрировали методом ультрафильтрации на полых волокнах ВПУ-50. ЦГТазную активность определяли модифицированным фенолфталеиновым методом. Аналитическое определение специфичности ЦГТаз осуществляли, используя в качестве субстрата 5%-ный картофельный крахмал в 50 мМ ацетате натрия. Реакцию осуществляли в течение 24 часов при рН=6,00,и 50оС. Количественное определение ЦД выполняли методом ВЭЖХ.

Все три культуры P. ehimensis, использованные в экспериментах, продемонстрировали хорошо детектируемый уровень внеклеточной ЦГТазной активности (2-3 ед./мл) в КЖ. Было показано, что оптимальный температурный режим циклизации наблюдается при рН=6,0 и 50оС, при этом добавление катионов двухвалентного кальция (5-15 мM) стабилизирует фермент. Характерной особенностью ЦГТаз изученной выборки штаммов P. ehimensis являлся необычный характер специфичности, не наблюдаемый с циклизующими ферментами бактерий других видов. Во всех случаях результатом увеличения удельной дозировки фермента по отношению к субстрату являлось смещение равновесия реакции в сторону образования гамма-ЦД. Обнаружение способности к образованию специфической ЦГТазы бактериями P. ehimensis открывает возможности для повышения эффективности существующих технологий продукции ЦД.

Pages:     | 1 |   ...   | 41 | 42 || 44 | 45 |   ...   | 83 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.