WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 83 |

Для ОТ-ПЦР использовали тотальную РНК, выделенную из яйцеклеток и эмбрионов на стадиях 2-х бластомеров, средней и поздней бластулы, ранней гаструлы, нейрулы и вылупления, а так же из головастиков и мозга взрослых лягушек X. laevis. Специфические олигонуклеотиды подбирали к последовательностям мРНК VMAT1 и VMAT2 X. laevis, а так же к консервативным участкам, выявленным при сравнении мРНК SERT Xenopus tropicalis и Danio rerio. Динамику экспрессии VMAT2 количественно исследовали методом ПЦР в реальном времени, в качестве эндогенного контроля использовали ген орнитиндекарбоксилазы, степень экспрессии рассчитывали относительно стадии бластомеров.

Экспрессия SERT выявлена на всех исследованных стадиях развития. Продукт ПЦР отсеквенирован, полученная нуклеотидная последовательность на 93% совпадает с мРНК SERT X. tropicalis. Экспрессия VMAT1 выявляется только на стадиях нейрулы, вылупления и головастика, а VMAT2 – в пробах ооцитов и ранних эмбрионов до стадии гаструлы.

Методом ПЦР в реальном времени установили, что экспрессия VMAT2 максимальна на стадии средней бластулы (125% относительно стадии 2 бластомеров), после чего уменьшается, составляя 60% на стадии ранней гаструлы, и менее 5% – на стадии нейрулы и вылупления.

Таким образом, на ранних стадиях развития X. laevis экспрессируются как SERT, осуществляющий обратный захват 5-НТ, так и VMAT, осуществляющий везикулярный транспорт моноаминов. Более выраженная экспрессия VMAT2 на донервных стадиях, резко снижающаяся после гаструляции, предполагает, что его функциональное значение более существенно именно в процессах раннего эмбриогенеза. Вместе с присутствием самого серотонина и уже продемонстрированной нами экспрессией рецепторов 5-HTR2C и 5-HTRна ранних стадиях развития X. laevis, полученные результаты свидетельствуют о том, что ранние эмбрионы Xenopus обладают основными компонентами, составляющими функциональную серотонергическую сигнальную систему.

Авторы благодарят д.б.н. Ю.Б. Шмуклера за помощь в подготовке тезисов. Работа поддержана грантом РФФИ № 08-04-00144.

Нарушение брачного поведения у самцов D. melanogaster, гетерозиготных по аллелю sbr12, связано с дефектами развития эллипсоидного тела нервного ганглия Никулина Анна Олеговна (Санкт-Петербургский Государственный Университет, Россия, Санкт-Петербург, anna.o.nikulina@gmail.com) Белок DmNXF1 (SBR) относится к эволюционно-консервативному семейству ядерных факторов экспорта NXF (Nuclear eXport Factors). Данный белок и его ортологи (MEX67p у S.cerevisiae, TAP (HsNXF1) у человека) обеспечивают экспорт всех мРНК из ядра в цитоплазму. Полученные нами ранее данные о характере экспрессии гена Dm nxf1 (sbr) в различных органах и тканях, а также аллель-специфичные проявления мутаций, среди которых известны затрагивающие поведение, позволяют предполагать, что данный ген является полифункциональным и играет особую роль в развитии и функционировании нервной системы дрозофилы.

В нашем распоряжении имеется коллекция линий D. melanogaster, несущих различные мутации в гене sbr. Наибольший интерес представляет рецессивная летальная мутация sbr12 с аллелеспецифичным доминантным эффектом. Самцы с генотипом sbr12/+, несущие аллель sbr12 в Х-хромосоме и аллель sbr+, транслоцированный в Y-хромосому, являются стерильными и имеют нарушения ряда параметров брачного поведения. Используя метод флуоресцентной конфокальной микроскопии, мы провели сравнение структуры нервных ганглиев самцов дикого типа (линия OregonR) и мутантных с генотипом sbr12/+.

Эксперименты показали, что у мутантных самцов структура нервного ганглия отличается от таковой у самцов дикого типа. Среди прочих дефектов, наиболее значимым являются изменения размера и структуры эллипсоидного тела – одного из нервных центров, контролирующих поведение насекомого. Количество нейронов, образующих эллипсоидное тело, у мутантов существенно ниже, чем в норме.

Известно, что нарушения структуры эллипсоидного тела у самцов дрозофилы приводит к нарушениям брачного поведения, что характерно и для самцов sbr12/+. Таким образом, нарушение брачного поведения у мутантов вызвано не только нарушением сперматогенеза, что может быть причиной отсутствия мотивации к спариванию, но и дефектами развития эллипсоидного тела. Полученные результаты позволяют утверждать, что ген Dm nxfявляется полифункциональным и относится к группе генов, важных и для нормального протекания сперматогенеза, и для нейрогенеза.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 09-04-00697.

Использование метода гаметического хроматина в экспериментальной нанотксикологии Павлюченкова Светлана Михайловна (Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, Москва, Россия, SmileSweta@yandex.ru) В связи с ускоренным развитием нанотехнологий проблема генетической и биологической безопасности приобретет большую актуальность, потому что природная среда пополнится новым классом раздражителей, обладающих цито - и генотоксической активностью. Встреча биологических систем с наноматериалами не исключает возможность катастрофических изменений первых. Уже появляются сведения о том, что многие наночастицы потенциально опасны для живых организмов.

Задача настоящей работы состояла в изучении эффектов действия наночастиц золота на спермии мышей. Для достижения поставленной цели была использована модельная система деконденсации ядерного хроматина in vitro, имитирующая процесс образования мужского пронуклеуса и выявляющая потенциальные повреждения в структуре ДНП-комплекса.

Суспензию спермиев готовили из каудальных отделов эпидидимиса половозрелых самцов мышей-гибридов CBAC57/Bl6.

Нами впервые показано, что обработка гамет, демембранизированных додецилсульфатом Na, в средах, содержащих наночастицы золота (диаметр частиц ~2.5 нм) в концентрации 1.0 x 1015 частиц/мл, и последующая инкубация в растворе дитиотреитола приводят к нарушению динамики процесса декомпактизации хроматина. По степени распаковки ядерного хроматина гаметы условно были разделены на три группы:

«интактные» (в целом не отличающиеся от нативных ядер), частично и полностью деконденсированные. Внешне структура частично и полностью деконденсированных ядер спермиев, обработанных наночастицами золота, резко отличалась от контрольных образцов, приобретая глыбчатую организацию хроматина вместо дисперсной. Площадь проекции полностью деконденсированных ядер была уменьшена приблизительно в 2 – 3 раза. При равных условиях эксперимента частота встречаемости интактных, частично деконденсированных и полностью деконденсированных ядер составляла в контроле 2, 18 и 80%, а в образцах, инкубировавшихся с наночастицами золота в течение 20 мин и 40 мин, соответственно 16, 80 и 4% и 60, 30 и 10%.

На основании этих наблюдений мы пришли к заключению, что наночастицы золота обладают сперматотоксическим действием, механизм которого, вероятно, связан с их взаимодействием с молекулами двухцепочечной ДНК.

Использованный в работе метод может оказаться весьма удобным и полезным при изучении цитотоксической активности наночастиц других металлов, а также наночастиц иного происхождения.

Изучение механизмов, регулирующих морфогенез в процессе регенерации хвоста тритона Pleurodeles waltl в условиях различной гравитационной нагрузки Радугина Елена Александровна (Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Россия, Москва, defishensy@gmail.com) Тритоны Pl.waltl обладают уникальными регенерационными способностями, например, полностью восстанавливают хвост после ампутации. Известно, что ход эпиморфной регенерации зависит от действия гравитации. Недавно выяснилось, что у тритонов в условиях перегрузки по сравнению с состоянием в аквариуме происходит изменение формы регенерата – загиб в дорсовентральной плоскости. Этот эффект можно рассматривать как пример эпигенетической регуляции морфогенеза, механизмы которой остаются малоизученными.

В экспериментах использовали 2 группы тритонов - группу на субстрате (1”g”, опыт) и в аквариуме (low “g”, контроль). Достоверность морфогенетического эффекта определяли морфометрическими методами с помощью программ компьютера, с последующей статистической обработкой данных. Регенераты на нескольких стадиях развития обрабатывали гистологическими и иммунохимическими методами.

Морфометрию регенератов в контроле и опыте (60 тритонов) проводили на нескольких сроках регенерации, вплоть до окончательного завершения морфогенеза. Значение угла загиба регенератов в опыте оказалось достоверно ниже, чем в контроле, с 21-го дня (начала морфогенеза); длина регенератов в двух группах не отличалась. На 42-й день регенерации значение угла загиба в контроле превышало значение в опыте вдвое (22, 44° и 44,84°).

Отличие оставалось значительным и по завершении морфогенеза, на стадии роста хвоста.

Различия в гистоструктуре регенератов в двух группах обнаруживались со стадии начала морфогенеза: в опыте наблюдались загиб эпендимной трубки и хрящевого тяжа книзу, конденсация бластемных клеток возле конца эпендимной трубки и увеличение сети меланоцитов на дорсальной стороне. На ранней стадии регенерации в опыте отмечалось утолщение дорсального эпидермиса: 7-8 слоев клеток по сравнению с 4-5 слоями в вентральном эпидермисе. Было определено соотношение количества пролиферирующих клеток, меченых бромдеоксиуридином, на вентральной и дорсальной стороне регенерата. В контроле на 7-й день оно равнялось 1,6 в эпидермисе и 2,0 в соединительной ткани, в опыте было ниже (0,6-1,4 и 1,1, соответственно).

Наблюдаемый морфогенетический эффект, по-видимому, во многом объясняется дифференциальной регуляцией пролиферации в разных зонах регенерата. Для понимания её механизма мы работаем над изучением влияния регуляторов пролиферативной активности клеток, в т.ч. факторов роста и белков теплового шока.

Использование атомно-силовой микроскопии для исследования распределения трансплантированных клеток стромы костного мозга при трансплантации in vitro Сергеев Сергей Александрович, Храмова Ю.В., Ефремов Ю.М.

(Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Москва, Россия, embryossa@gmail.com) Применение методов атомно-силовой микроскопии и органотипического культивирования позволяет детально описать морфологические преобразования, происходящие с клетками, введенными в ткань реципиента, проследить их пути миграции и оценить перспективность применения в регенеративной медицине.

Культивирование сетчатки проводили в виде эксплантатов в среде DMEM/F12 с 20нг/мл FGF и EGF, 7% FCS, гепарином, добавками В12 и N2. Для трансплантации использовали EGFP+ клетки стромы костного мозга (ММСК) 4-го пассажа в концентрации 1000-клеток в 0,1мкл среды. АСМ-изображения были получены на атомно-силовом микроскопе Solver BIO Olympus (НТ-МДТ, Россия, Зеленоград), с полем сканирования 100х100х7 мкмАнализ изображений был проведен в программах Nova (НТ-МДТ) и STATISTICA 8.0.

Показано морфологическое преобразование трансплантированных ММСК в клетки с нейрональным фенотипом, их активная миграция до 3-х суток после инъекции и образование биполярных и мультиполярных нейритоподобных выростов. Выселению клеток из эксплантата сетчатки предшествовало образование ламеллоподиальных выростов (средняя длина 10,09мкм, средний диаметр 3,68мкм). К 7 суткам культивирования наблюдалось увеличение их протяженности (средняя длина 21,65мкм, средний диаметр 0,78мкм). По поверхности глиальных и эндотелиальных клеток происходило распространение нейритов, которые достигали нескольких миллиметров в длину и до 0,47мкм в диаметре. Показано достоверное отличие (p<0,01) в величине отростков, формируемых глиальными и эндотелиальными компонентами сетчатки и высотами отростков нейронов и трансплантированных ММСК. Показано отсутствие достоверных отличий (p=0,52) в средней квадратичной шероховатости поверхности трансплантированных ММСК, изменивших свою морфологию на нейроноподобную и нейронов сетчатки, а так же отсутствие достоверных отличий (p=0,26) при сравнении асимметрии распределения отростков трансплантированных клеток и нейронов эксплантата сетчатки. Не удалось выявить достоверных различий и в размахе высот отростков между ММСК и нейронами сетчатки при наличии достоверных различий (p<0,01) высот отростков этих клеток с высотами отростков глиальных и эндотелиальных клеток сетчатки. Таким образом, полученные данные позволяют говорить о морфологическом преобразовании ММСК в нейроноподобные клетки, способные к установлению взаимосвязей с клетками сетчатки, однако вопрос функционального замещения нейронов трансплантированными стволовыми клетками остается открытым.

Работа выполнена при реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 – 2013 годы.

Влияние тяжелой воды на двигательную активность сперматозоидов человека Страшнова Аглая Львовна (Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, Москва, Россия, aglayakonkova@mail.ru) Известно, что высокие концентрации тяжелой воды (D2O) токсичны для сперматозоидов млекопитающих. В то же время, влияние малых концентраций тяжелой воды и легкой (1H2O) воды на двигательную активность и выживаемость сперматозоидов остается неизвестным.

Последнее стало целью нашего исследования.

Объектом исследований были очищенные от семенной плазмы и круглых клеток центрифугированием в градиенте плотности перколла сперматозоиды человека.

Двигательную активность сперматозоидов регистрировали с помощью анализатора изображений АТ-05. В качестве инкубационной среды использовали солевую среду Тироде, приготовленную на дистиллированной воде, служившую контролем. В опытах использовали среды, приготовленные на легкой воде и на смеси легкой и тяжелой воды с 0,5%, 1%, 5%, 10% и 20% содержанием D2O. Влияние растворов с разным содержанием тяжелой воды оценивали статистическими методами.

В среде, содержащей 20% D2O,сперматозоиды быстро теряют двигательную активность и гибнут. В среде с 10% D2O подвижность сперматозоидов снижается вдвое в 3 раза быстрее в сравнении с контролем. В среде с 5% D2O отчетлива тенденция снижения подвижности.

Достоверных отличий двигательной активности и жизнеспособности сперматозоидов в средах с 0,5%, 1% и 5% содержанием тяжелой воды в сравнении с контролем не выявлено.

Таким образом, низкие концентрации тяжелой воды, в отличие от высоких (10%, 20%), не оказывают выраженного токсического воздействия на сперматозоиды человека. В отсутствие тяжелой воды (т.е. в протиевой воде) происходит значимая активация движения сперматозоидов в сравнении с контролем.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 83 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.