WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 83 |

В опыте использовались полученные плотные (106 кл/мл) первичные культуры молодых (3-7 мес) и старых ( 2 года) крыс и редкие (105 кл/мл ) культуры, моделирующие потерю кооперативных свойств гепатоцитов при старении. Уровень Ca2+ определяли по его связыванию со специфическим флуоресцентным красителем Fluo-3 AM. Регистрацию интенсивности свечения каждой отдельной клетки регистрировали на конфокальном микроскопе Carl Zeiss двумя способами: (1) прижизненно (около 80 серий с интервалом от 10-12 секунд, общее время съемки 1 стекла 20 мин) и (2) изготавливались фиксированные с 5-10 минутным интервалом в течение часа препараты культур. Сопоставляли динамику изменения уровня Ca2+ в гепатоцитах контрольных культур и культур после импульсной обработки Mel (100 нМ).

1) Для плотных контрольных культур молодых крыс была выявлена синхронность для 89% клеток (КК=0,212), в редких культурах- 51-71% (КК=0,211-0,217), при этом синхронность наблюдалась в кластерах клеток, территориально обособленных, при обработке данных культур гормоном синхронизацию наблюдали в 100% клеток. При обработке Mel культур старых крыс синхронизировалось до 72% клеток (КК=0,5-0,84), тогда как в контроле наблюдалась полная асинхронность.

2) При сравнении контрольных и обработанных Mel культур разновозрастных крыс наблюдалось увеличение относительного уровня флуоресценции, что доказывает положительное влияние гормона на обмен Ca2+.

Таким образом, показано, что гормон мелатонин способен повышать степень синхронности изменения уровня ионов Ca2+ в гепатоцитах в культурах молодых и старых крыс.

Выражаю благодарность научному руководителю Бурлаковой О. В. за содействие и поддержку (профессиональную и личную).

мРНК гена половой плазмы Germes шпорцевой лягушки способна проникать через щелевые контакты из ооцита в фолликулярные клетки Кондукторова Виктория Владимировна (Институт Молекулярной Биологии РАН, Россия, Москва, virgo584@yandex.ru) У Xenopus линия первичных половых клеток закладывается в результате наследования цитоплазматического материала материнского происхождения, называемого половой плазмой. Половая плазма состоит из РНК, митохондрий, ЭР и половых гранул. В нашей лаборатории было показано, что Germes является маркером половой плазмы. Изучая локализацию белка Germes в яичниках шпорцевой лягушки с помощью иммунной сыворотки, мы обнаружили любопытный факт: белок Germes в значительном количестве содержится в фолликулярных клетках (ФК), окружающих растущие ооциты (Оо).

Упоминания в литературе о локализации в ФК генов-маркеров половой плазмы нами не обнаружено. ФК формируются из ткани яичника и не являются потомками клеток зародышевой линии. Мы попытались ответить на вопрос: возможен ли транспорт мРНК Germes в фолликулярный слой из ооцита, где, как известно, он экспрессируется.

Для проверки возможности транспорта мРНК генов-маркеров половой плазмы из Оо в ФК был использован конструкт, содержащий Germes, слитый с зеленым флуоресцентным белком (GFP-Germes), мРНК которого можно отличить в эксперименте от эндогенного транскрипта Germes. В ооциты cт. VI с сохраненным фолликулярным слоем инъецировали 12 нг мРНК GFP-Germes и мРНК GFP в качестве неспецифической контрольной мРНК.

Ооциты инкубировали in vitro в течение суток, затем фолликулярные оболочки механически отделяли от Оо, с последующим выделением тотальной РНК из обоих видов ткани. С помощью метода ОТ-ПЦР с праймерами к GFP было показано, что мРНК GFP-Germes присутствует как в Оо, так и в ФК, тогда как мРНК GFP - только в Оо. Таким образом, удалось показать возможность транспорта мРНК с молекулярным весом 1800 пн из ооцита в ФК. Причем проницаемость для мРНК оказалась высокоселективной для гена половой плазмы Germes, в отличие от мРНК GFP.

Транспорт осуществляется, по-видимому, через щелевые контакты. Прохождению таких молекул способствует наличие градиента электрической напряженности. Осуществляется ли обнаруженный в эксперименте транспорт Germes из ооцита в ФК и обратно в нормальном развитии, и каково его значение Результаты дают толчок к новым исследованиям.

Исследования финансировались РФФИ грантом № 09-04-01444.

Регуляторная роль механических напряжений в морфогенезе и экспрессии генов структурных белков в эксплантатах эмбриональных тканей Xenopus laevis.

Кремнёв Станислав Валерьевич1, Никишин Д.А.2, Глаголева Н.С.(1Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Россия, Москва, Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН, Россия, Москва, s.kremnyov@googlemail.com) Для изучения феномена механозависимости морфогенеза мы использовали модель сжатого двойного эксплантата крыши бластоцеля Xenopus laevis. Цейтраферная съемка согнутых двойных эксплантатов крыши бластоцеля показала, что в течение 2-3 ч культивирования наблюдается самоусиление навязанной кривизны. На вогнутой (сжатой) и выгнутой (растянутой) сторонах эксплантатов форма клеток заметно отличается. На вогнутой стороне эпителиальные клетки удлиняются, при этом их апикальная поверхность сокращаются, в то время как на выгнутой стороне клетки сохраняют свою изначально кубическую форму. Как морфометрический параметр мы использовали апикальный индекс (AI): отношение длины клетки к ширине апикального домена. К 2 часам устанавливается максимальная разница AI вогнутой и выгнутых сторон. При помощи витальной липофильной краски FM 4-64FX было обнаружено, что по сравнению с выгнутой стороной на вогнутой стороне идет активный эндоцитоз, видимо приводящий к апикальному сокращению.

Для установления механизма изменения формы клеток в ответ на сжатие мы использовали ингибиторы работы цитоскелета и белков, регулирующих его работу. Как оказалось, миозин II является наиболее важным участником в изменении формы клеток, как при апикальном сокращении, так и при удлинении эпителиальных клеток.

Также мы исследовали влияние растяжения на изменение экспрессии генов структурных белков. Растяжение двойных эксплантатов вентральной эктодермы в течение 70 мин приводит к существенному увеличению (на 20%) экспрессии гена claudin4 – главного белка плотных контактов. Интересно, что в тоже время экспрессия второго компонента плотных контактов occludin уменьшается на 6-7%. Что касается внутриклеточных компонентов плотных контактов, то экспрессия ZO-1 падает на 2-3%, ZO-2 и ZO-3, вероятно, не изменяется. Также исследовали влияние растяжения на экспрессию комплекса кадгериновых контактов. Экспрессия E-cadherin падает примерно на 3-4%, -catenin падает на 7% процентов, экспрессия catenin-p120 вероятно не изменяется. Данные результаты позволяют сделать предположения о регуляционной роли механических напряжений в дифференциальной клеточной адгезии, которая в свою очередь является одним из движущих факторов пространственного расположения эмбриональных закладок.

Характеристика культуры клеток Сертоли, полученных от половозрелых мышей Малолина Екатерина Андреевна 1, Кулибин А.Ю.(1 Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, Москва, Россия 2Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН, Москва, Россия, kate-malolina@mail.ru) Показано, что недифференцированные, пролиферирующие клетки Сертоли (КС) неонатальных мышей при трансплантации в семенники взрослых мышей способны формировать структуры, подобные семенным канальцам, и поддерживать сперматогенез.

Дифференцированные неделящиеся КС половозрелых животных такими свойствами не обладают. Однако есть данные, что в условиях in vitro такие КС вновь приобретают способность к делению, и возможно, при трансплантации поведут себя подобно неонатальным КС. Цель работы – охарактеризовать культуру КС взрослых мышей для последующих трансплантационных экспериментов. Суспензии клеток семенников 2-мес.

мышей линии C57Bl/6 высаживали в концентрации 3.5105 к-к/см2 в среде MEM/F12 с добавлением 1% FBS, инкубировали при 37°С, через сутки после начала культивирования убирали все неприкрепившиеся клетки. Культуру фиксировали на 3, 5, 8, 13, 20-е сут и анализировали с помощью иммуноцитохимии. Число клеток в культуре увеличивалось: от 4.6103 к-к/см2 на 5-е сут до 9.4103 к-к/см2 на 20-е сут. Увеличивалось число vimentin+клеток: с 75.8% на 3-и сут до 93.4% на 20-е сут (vimentin – белок цитоскелета КС, но также и перитубулярно-мышечных клеток). Экспрессия Wt1, маркера КС in vivo, исчезала у части КС, определяемых по морфологическим признакам, уже на 3-и сут фиксации, что, возможно, связано с культивированием КС при 37°С, а не при 33°С (как в семенниках). Тем не менее, число Wt1+-КС в культуре достоверно росло: с 31.1% на 3-и сут до 57.8% на 20-е сут, с 8-х сут Wt1+-КС формировали колонии. Анализ двойного окрашивания на vimentin и BrdU показал, что содержание vimentin+/BrdU+-клеток увеличивается с 21% на 3-и сут до 28.7% на 13-е сут, а к 20-м сут снижается (19%), что, вероятно, связано с контактным торможением пролиферации. Двойное окрашивание на Wt1 и BrdU показало, что большая часть BrdU+клеток является также Wt1+, что достоверно подтверждает пролиферацию КС. В культуре присутствовали cytokeratin 18+-клетки (cytokeratin 18+ – маркер недифференцированных КС), однако их процент со временем падал, немногие из них включали BrdU. Таким образом, отработаны условия культивирования КС, стимулирующие их пролиферацию. Оптимальный срок для трансплантации КС – 13-е сут, когда их пролиферация достигает максимума.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 10-04-00816.

Восстановление индуцирующих свойств культуры клеток волосяного сосочка Мягкова Екатерина Павловна (Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН, Россия, Москва, katerina.myagkova@gmail.com) Клетки волосяного сосочка индуцируют образование волосяного фолликула, однако их индуцирующие способности теряются при культивировании. Частично их восстановить можно путем реконструкции ниши волосяного сосочка в культуре. В данной работе для этого использовали различные факторы роста и цитокины, компоненты межклеточного матрикса и различные способы культивирования (монослойные и сферические культуры). В качестве меры индуцирующих способностей использовалось окрашивание на щелочную фосфатазу — маркер клеток волосяного сосочка.

С увеличением числа пассажей интенсивность окрашивания клеток снижалась.

Замедлить это явление позволяло добавление в среду BMP6 и витамина D3, использование среды, кондиционированной кератиноцитами, сорбирование компонентов межклеточного матрикса: аггрекана и фибронектина, а также использование сферических культур. При этом получение сфероидов из суспензии клеток поздних пассажей приводило к восстановлению интенсивности окраски.

Добавление компонентов межклеточного матрикса приводило к лучшим результатам по сравнению с факторами роста. В дальнейшем планируется развивать это направление, используя компоненты базальной мембраны и 3D культивирование.

Временные параметры онтогенеза и способы его регуляции Налобин Денис Сергеевич (Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, Россия, Москва, d.s.nalobin@gmail.com) Изучение времени как естественнонаучной и философской категории имеет долгую, более 25 столетий, историю. Это один из основных параметров развития, заслуживающий пристального внимания. Представляется интересным каким образом возможно контролировать биологическое время, т.е. скорость онтогенеза. Целью данной работы является экспериментальное изменение темпов развития низших позвоночных. Были поставлены следующие задачи: (1) анализ параметров эмбрионального развития при разных температурных условиях; (2) анализ параметров эмбрионального развития зародышей после их взаимодействия в оптическом диапазоне; (3) исследование эффекта дистантного взаимодействия при изменении оптических параметров среды между взаимодействующими объектами с помощью прецизионных оптических систем, применяемых в космонавтике:

призменные уголковые световозвращатели (УСВ). Работа выполнена на вьюне Misgurnus fossilis L. (Cobitidae, Cypriniformes, Teleostei, Pisces). Икру получали стандартным методом гормональной стимуляции. Оплодотворение яйцеклеток осуществляли сухим способом.

Были проведены серии опытов при различных температурах (+130, +150, +170, +200С) и вариантах оптических контактов зародышей. Темпы развития зависят от качества икры: чем лучше качество, тем быстрее и более синхронно развитие всех зародышей данной группы, а при низком качестве ярче выражены рассинхронизация и замедление развития. Как и ожидалось, скорость эмбриогенеза зависела от температурных условий: чем выше температура, тем быстрее протекает развитие и ярче выражена рассинхронизация развития внутри исследуемой группы; при низкой температуре наблюдается замедление развития и синхронизация внутри исследуемой группы. Эффекты температурного воздействия на протяжении последующего онтогенеза не сохраняются. Оптический контакт изолированных групп зародышей низших позвоночных приводит к изменению темпа развития, процента эмбриональной смертности и появлению аномально развивающихся особей. Наблюдаемые эффекты стадиоспецифичны. Последствия оптического взаимодействия могут сохраняться на протяжении онтогенеза, проявляясь в изменении темпов вылупления, роста предличинок, становления основных систем органов. Использование УСВ позволяет обеспечить выживание значительного количества особей, находящихся в условиях, практически не совместимых с жизнью. Использование УСВ на ранних стадиях развития живых организмов позволит в перспективе проводить коррекцию нарушения нормального развития в эмбриональном периоде.

Экспрессия транспортёров серотонина в эмбриогенезе Xenopus laevis Никишин Денис Александрович1, Кремнёв С. В.(1Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН, Россия, Москва, 2Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Россия, Москва, denisnikishin@gmail.com) На ранних стадиях эмбрионального развития шпорцевой лягушки Xenopus laevis показано присутствие и функциональная активность классического трансмиттера серотонина (5-НТ). В частности, показана возможная роль 5-НТ и систем его транспорта в установлении лево-правой асимметрии. Целью данной работы было исследование экспрессии транспортера серотонина (SERT) и везикулярных транспортеров моноаминов (VMAT) в эмбриогенезе X. laevis.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 83 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.