Выделяют L-ПК печени, М1-изоформу мозга и скелетной мускулатуры, а также R-ПК, обнаруженную в эритроцитах. При злокачественной трансформации клеток вышеперечисленные изоформы ПК димеризуются и превращаются в опухолевый изофермент (Tu-ПК), молекулярно-биохимические особенности функционирования которого в настоящее время окончательно не установлены.
В связи с этим, настоящая работа посвящена сравнительной характеристике особенностей ферментативного катализа нормальной (М1-) и опухолевой (Tu-) изоформ пируваткиназы (ПК).
Исследование М1-ПК проводилось в цитозольной фракции скелетной мускулатуры крыс, Tu-ПК – в гомогенатах клеток линии Kasumi -1 (острый миелоидный лейкоз человека).
Активность фермента измерялась в сопряженной с лактатдегидрогеназой ферментной системе. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью пакета программ Stadia 6.0.
В ходе работы установлены следующие различия параметров биокатализа изоферментов ПК: оптимум рН для М1- ПК соответствует величине 7,5; для Tu-ПК – 9,0. Определены константы Михаэлиса для М1- и Tu-форм ПК по фосфоенолпирувату, составившие 2,0·10-моль/л и 1,8·10-6 моль/л, соответственно, и по АДФ – 2,5·10-4 моль/л и 5,3·10-6 моль/л для М1- и Tu-ПК, соответственно. Максимально эффективная концентрация природного ингибитора ПК – фенилаланина - составляет 1 ммоль/л для М1-ПК и 0,5 ммоль/л для опухолевого фермента. Оптимальное для проявления ингибиторного эффекта значение рН соответствует величинам 7,5 (М1-ПК) и 9,0 (Tu-ПК). Константы полуингибирования (IC50) для данного ингибитора составили 1,6 ммоль/л (М1-ПК) и 0,8 ммоль/л (Тu-ПК). Установлена способность 5 ммоль/л аланина предотвращать ингибиторное действие фенилаланина для обоих исследованных изоферментов.
Таким образом, в ходе проведенной работы установлены различия нормальной и опухолевой изоформ ПК по величине оптимума рН катализируемой реакции, величине Km для обоих субстратов (АДФ и фосфоенолпирувата), условиям реализации аллостерического эффекта фенилаланина.
Автор глубоко благодарен научному руководителю - к. б. н., доценту О.И. Губич и аспиранту БГУ Д. Посреднику за всестороннюю помощь в проведении работы.
Регуляция связи митохондрий с виментином при участии малой ГТФазы RacКамынина Алиса Игоревна (Институт белка РАН, Россия, Москва, alisa_kamynina@hotmail.com) Для правильного функционирования митохондрий необходимо их определенное распределение в клетке, которое достигается в результате их взаимодействия с цитоскелетными структурами: микротрубочками, актиновыми микрофиламентами и промежуточными филаментами. В нашей лаборатории было показано, что виментиновые промежуточные филаменты регулируют не только распределение и подвижность митохондрий, но также их потенциал и чувствительность к оксидативному стрессу. За взаимодействие с митохондриями отвечает N-концевой участок молекулы виментина, расположенный между аминокислотными остатками 44 – 69.
Этот участок содержит несколько остатков Ser, которые могут фосфорилироваться под действием различных протеинкиназ и тем самым регулировать связь виментиновых филаментов с митохондриями. Известно, что протеинкиназа РАК-1 (один из эффекторов малой ГТФазы Rac1) способна фосфорилировать виментин по Ser56. С другой стороны, ранее в нашей лаборатории было показано, что малая ГТФаза RhoА регулирует подвижность митохондрий, и ее активация приводит к уменьшению подвижности митохондрий.
В данной работе нами были проведены опыты для выяснения возможной роли малой ГТФазы Rac1 в регуляции связи виментиновых филаментов с митохондриями и изменении подвижности митохондрий. Используя конститутивно-активный мутант белка Rac1, мы убедились в том, что этот белок увеличивает подвижность митохондрий. Далее мы обнаружили, что эффект Rac1 на митохондрии обусловлен действием ее эффектора РАК-1.
Так, Rac1 не влияет на подвижность митохондрий в присутствии доминантно негативного мутанта РАК-1, или если виментин содержит мутацию S56A.
Таким образом, малая ГТФаза Rac1 регулирует связь виментиновых промежуточных филаментов с митохондриями через свой эффектор протеинкиназу РАК-1, которая фосфорилирует виментин по Ser56.
Активность NADPH-цитохром Р-450-редуктазы в микросомальной фракции карциномы Герена крыс-опухоленосителей Кеца Оксана Виталиевна, Немиш В.В (Черновицкий национальный университет им. Ю.Федьковича, Украина, Черновцы, ksen808@mail.ru) В функционировании цитохром Р-450-зависимой микросомальной редокс-цепи большое значение имеет флавопротеид – NADPH-цитохром Р-450-редуктаза, изменение активности которого может привести к изменениям каталитической активности цитохрома Р-450.
Изучение функционирования компонентов биотрансформации лекарств опухолевой ткани на разных этапах онкогенеза открывает перспективы для выяснения механизмов резистентности опухоли к лекарственным препаратам.
Цель работы – исследовать активность NADPH-цитохром Р-450-редуктазы в микросомальной фракции карциномы Герена крыс на разных стадиях развития.
Исследования показали, что в период интенсивного роста карциномы Герена в микросомальной фракции активность NADPH-цитохром Р-450-редуктазы снижается в 2,раза в сравнении с исследуемыми показателями, характерными в латентный период роста карциномы. Уменьшение активности NADPH-цитохром Р-450-редуктазы снижает вероятность переноса электронов на цитохром Р-450, вследствие чего снижается роль последнего в метаболизме лекарственных препаратов в опухолевой ткани. С другой стороны, снижение ферментативной активности NADPH-цитохром Р-450-редуктазы и цитохрома Р-450 в опухолевой ткани может иметь протективное значение, поскольку их функционирование может не только инактивировать токсичные метаболиты, а наоборот, трансформировать их в соединения более опасные, чем исходные.
На терминальном этапе роста карциномы Герена наблюдается повышение активности NADPH-цитохром Р-450-редуктазы. Известно, что данный энзим владеет способностью самостоятельно катализировать некоторые оксигеназные и редуктазные реакции, принимать участие в реакциях перекисного окисления липидов (ПОЛ), поэтому повышение NADPHцитохром Р-450-редуктазной активности в опухолевой ткани может быть связано с участием данного фермента в интенсификации процессов ПОЛ, которые наблюдаются в ткани карциномы Герена в этот период онкогенеза.
Таким образом, в период интенсивного роста в организме карциномы Герена в микросомальной фракции наблюдается снижение активности NADPH-цитохром Р-450редуктазы. Активация фермента на терминальной стадии онкогенеза может быть обусловлена участие энзима в свободнорадикальных процессах клетки.
Изучение взаимодействия кардиотонических стероидов с Na,K-ATPазой Климанова Елизавета Андреевна (Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Россия, Москва, lehorsla@yandex.ru) За последние годы появилось множество работ, свидетельствующих о том, что помимо основной функции Na,K-ATPазы, связанной с поддержанием неравновесного распределения ионов Na+ и К+, данный фермент выступает в роли рецептора кардиотонических стероидов и за счет этого способен участвовать в регуляции пролиферации и смерти клеток. Разными группами исследователей были получены многочисленные данные о способности кардиотонических стероидов, помимо ингибирования Na,K-ATPазы, активировать сигнальные каскады клетки, включая рецепторы инозитол-3-фосфата, высвобождение внутриклеточного Са2+ и активных форм кислорода, Src-киназу, эпидермальный фактор роста (EGFR), протеинкиназу Ras, фосфоинозитол-3-киназу (PI3K) и митоген-активируемую протеинкиназу (MAPK) Erk 1/2. В связи с этим изучение взаимодействия кардиотонических стероидов с Na,K-ATPазой представляет интересную проблему.
Основываясь на данных о различии физиологических эффектов при взаимодействии разных кардиотонических стероидов (уабаина и маринобуфагенина) с Na,K-насосом, мы предполагаем существование разницы в параметрах подобных взаимодействий. В данной работе мы использовали почки кролика, из которых был получен очищенный препарат Na,KATPазы. Изучение взаимодействия полученного белка с КТС осуществляли посредством измерения флуоресценции ФИТЦ-меченных препаратов фермента, а также методом изотермической калориметрии титрования.
Изучение параметров взаимодействия уабаина с Na,K-ATPазой с помощью измерения изменений флуоресценции ФИТЦ-меченного белка и методом изометрической калориметрии титрования показало схожие результаты. Константа связывания примерно равна 1*105, а стехиометрия связывания, которую удалось установить с помощью калориметрии титрования, составила 0,3. Мы планируем изучить также параметры взаимодействия Na,K-ATPазы с маринобуфагенином, стероидом другой природы. Это позволит шире посмотреть на проблему ингибирования фермента кардиотоническими стероидами с последующей активацией сигнальных каскадов клетки, а также установить связь между параметрами взаимодействия КТС с Na,K-ATPазой и физиологическими эффектами.
Изменения внутриклеточного рН в гепатоцитах миноги (Lampetra fluviatilis L.) в период метаболической депрессии Коновалова Светлана Александровна (Институт эволюционной физиологии и биохимии им. Сеченова РАН, Россия, Санкт-Петербург, svetakonovalova@gmail.com) Гепатоциты миноги в последнюю зиму жизненного цикла, когда выключено экзогенное питание, представляют собой уникальную естественную модель для изучения процессов обратимой метаболической депрессии. Осенью, в самом начале миграции, гепатоциты метаболически активны, однако в результате длительного голодания развивается ярко выраженная метаболическая депрессия, которая весной, непосредственно перед нерестом, сменяется кратковременной активацией метаболизма.
Концентрация адениновых нуклеотидов была определена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, митохондриальный мембранный потенциал – на проточном цитометре и конфокальном микроскопе с помощью потенциал-зависимых флуоресцентных красителей (TMRM, DiOC6, JC-1 и MTG), а внутриклеточный рН - флюоресцентным красителем SNARF-1 AM.
Обнаружено, что в период с сентября по декабрь концентрация АТФ в кусочках печени миноги снижается с 0,8 до 0,2 нмоль/мг влажной массы, а энергетический заряд Аткинсона падает до критически низких значений – 0,2-0,3. Митохондриальный мембранный потенциал также снижается к зиме, достигая минимума в январе. Однако весной, начиная с марта, концентрация АТФ, заряд Аткинсона и митохондриальный потенциал возрастают, приближаясь к осенним значениям. При этом выявлены значительные сезонные изменения внутриклеточного рН гепатоцитов миноги. Зимой, величина внутриклеточного рН (рНi) на 0,3 единицы меньше, чем рН среды инкубации (рНe): pHi = 6,2 при pHe = 6,5 и pHi = 7,3 при pHe = 7,6. Закисления внутриклеточной среды в осенний и весенний периоды не происходит.
Таким образом, сезонные изменения рНi в гепатоцитах миноги хорошо коррелируют с энергетическим статусом клеток – зимой, когда концентрация ATP, энергетический заряд Аткинсона и митохондриальный мембранный потенциал минимальны, наблюдается закисление внутриклеточного пространства в гепатоцитах по сравнению с периодами метаболической активности (весна, осень). Известно, что при метаболической депрессии снижение рН является одним из наиболее эффективных способов защиты клетки от некроза.
Гистон Н1/ОБМ гидролизующие IgG как потенциальные маркеры в диагностике тяжести протекания системной красной волчанки Корний Наталья Сергеевна (Львовский национальный университет им. И.Я. Франко, Украина, Львов, aliakorniy@mail.ru) Антитела, обладающие способностью катализировать химические реакции, получили название каталитически активных антител, или абзимов. Наличие абзимов в сыворотке крови больных служит важным диагностическим показателем тяжести протекания различных аутоиммунных заболеваний. Нами впервые было установлено, что в сыворотке крови больных системной красной волчанкой (СКВ) присутствуют протеолитически активные IgG-антитела (протабзимы), обладающие способностью расщеплять гистон Н1 и основной белок миелина (ОБМ). Абзимы с подобной каталитической активностью не были обнаружены в сыворотке крови клинически здоровых людей.
В данной работе было решено установить взаимосвязь между протеолитической активностью IgG-антител сыворотки крови больных СКВ относительно гистона H1 и ОБМ и особенностями протекания этой болезни.
Было обследовано 38 больных на СКВ возрастом 13-71 года, из которых 34 (89,5%) – женщины. Диагноз СКВ был подтвержден клиническими и лабораторными данными, согласно критериям АСК (1997). IgG выделяли из сыворотки крови хроматографией на протеин G-сефарозе. Субстратами протеолитической реакции служили коммерческие препараты ОБМ и гистона Н1. Протеолитическую активность антител определяли электрофорезом в 12% ПААГ в присутствии 0,1% SDS.
Установлено, что 15 из 38 препаратов IgG (39,5%) у обследованных пациентов, больных СКВ, с разной эффективностью гидролизируют гистон Н1 и ОБМ. При этом, 14 из больных СКВ с обнаруженными в сыворотке крови протабзимами находились на стадии обострения болезни (93,3%).
Таким образом, протеолитическая активность IgG-антител сыворотки крови больных СКВ относительно гидролиза гистона Н1 и основного белка миелина коррелирует с обострением болезни и может служить важным маркером тяжести протекания этого заболевания.
Выделение и структурно-функциональная характеристика нового трехпетельного токсина из яда кобры Naja kaouthia Мещерякова Анна Владимировна (Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова РАН, Россия, Москва, iozefkneht@yandex.ru) Структурно-функциональная характеристика нейрорецепторов является важной задачей в связи с вовлеченностью этих рецепторов в патогенез нервных и психических заболеваний.
Так называемые трёхпетельные токсины змей за счет селективности действия являются незаменимыми инструментами в исследовании нейрорецепторов.
В нашей лаборатории путем поэтапной жидкостной хроматографии был выделен новый трёхпетельный токсин из яда кобры Naja kaouthia (Lesson,1831).
Сухой яд кобры разделяли на гель-фильтрационной колонке, после чего фракция vбыла обессолена и затем нанесена на катионообменную колонку, на которой исследуемый токсин в силу своей кислой природы не сорбировался. Последующее разделение включало в себя этапы обессоливания, анионообменной и обратнофазовой хроматографии.
Согласно данным масс-спектрометрии, масса выделенного токсина (а21.1) составляет 6845 Да. Его первичная структура имеет высокую степень гомологии (89-91% идентичных аминокислотных остаков) с последовательностями трехпетельных токсинов (ТПТ) группы ХХ (по классификации Fry, 2003), так называемых «орфанотоксинов», мишень действия которых на сегодняшний момент не определена.
