Выделяют L-ПК печени, М1-изоформу мозга и скелетной мускулатуры, а также R-ПК, обнаруженную в эритроцитах. При злокачественной трансформации клеток вышеперечисленные изоформы ПК димеризуются и превращаются в опухолевый изофермент (Tu-ПК), молекулярно-биохимические особенности функционирования которого в настоящее время окончательно не установлены.
В связи с этим, настоящая работа посвящена сравнительной характеристике особенностей ферментативного катализа нормальной (М1-) и опухолевой (Tu-) изоформ пируваткиназы (ПК).
Исследование М1-ПК проводилось в цитозольной фракции скелетной мускулатуры крыс, Tu-ПК – в гомогенатах клеток линии Kasumi -1 (острый миелоидный лейкоз человека).
Активность фермента измерялась в сопряженной с лактатдегидрогеназой ферментной системе. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью пакета программ Stadia 6.0.
В ходе работы установлены следующие различия параметров биокатализа изоферментов ПК: оптимум рН для М1- ПК соответствует величине 7,5; для Tu-ПК – 9,0. Определены константы Михаэлиса для М1- и Tu-форм ПК по фосфоенолпирувату, составившие 2,0·10-моль/л и 1,8·10-6 моль/л, соответственно, и по АДФ – 2,5·10-4 моль/л и 5,3·10-6 моль/л для М1- и Tu-ПК, соответственно. Максимально эффективная концентрация природного ингибитора ПК – фенилаланина - составляет 1 ммоль/л для М1-ПК и 0,5 ммоль/л для опухолевого фермента. Оптимальное для проявления ингибиторного эффекта значение рН соответствует величинам 7,5 (М1-ПК) и 9,0 (Tu-ПК). Константы полуингибирования (IC50) для данного ингибитора составили 1,6 ммоль/л (М1-ПК) и 0,8 ммоль/л (Тu-ПК). Установлена способность 5 ммоль/л аланина предотвращать ингибиторное действие фенилаланина для обоих исследованных изоферментов.
Таким образом, в ходе проведенной работы установлены различия нормальной и опухолевой изоформ ПК по величине оптимума рН катализируемой реакции, величине Km для обоих субстратов (АДФ и фосфоенолпирувата), условиям реализации аллостерического эффекта фенилаланина.
Автор глубоко благодарен научному руководителю - к. б. н., доценту О.И. Губич и аспиранту БГУ Д. Посреднику за всестороннюю помощь в проведении работы.
Регуляция связи митохондрий с виментином при участии малой ГТФазы RacКамынина Алиса Игоревна (Институт белка РАН, Россия, Москва, alisa_kamynina@hotmail.com) Для правильного функционирования митохондрий необходимо их определенное распределение в клетке, которое достигается в результате их взаимодействия с цитоскелетными структурами: микротрубочками, актиновыми микрофиламентами и промежуточными филаментами. В нашей лаборатории было показано, что виментиновые промежуточные филаменты регулируют не только распределение и подвижность митохондрий, но также их потенциал и чувствительность к оксидативному стрессу. За взаимодействие с митохондриями отвечает N-концевой участок молекулы виментина, расположенный между аминокислотными остатками 44 – 69.
Этот участок содержит несколько остатков Ser, которые могут фосфорилироваться под действием различных протеинкиназ и тем самым регулировать связь виментиновых филаментов с митохондриями. Известно, что протеинкиназа РАК-1 (один из эффекторов малой ГТФазы Rac1) способна фосфорилировать виментин по Ser56. С другой стороны, ранее в нашей лаборатории было показано, что малая ГТФаза RhoА регулирует подвижность митохондрий, и ее активация приводит к уменьшению подвижности митохондрий.
В данной работе нами были проведены опыты для выяснения возможной роли малой ГТФазы Rac1 в регуляции связи виментиновых филаментов с митохондриями и изменении подвижности митохондрий. Используя конститутивно-активный мутант белка Rac1, мы убедились в том, что этот белок увеличивает подвижность митохондрий. Далее мы обнаружили, что эффект Rac1 на митохондрии обусловлен действием ее эффектора РАК-1.
Так, Rac1 не влияет на подвижность митохондрий в присутствии доминантно негативного мутанта РАК-1, или если виментин содержит мутацию S56A.
Таким образом, малая ГТФаза Rac1 регулирует связь виментиновых промежуточных филаментов с митохондриями через свой эффектор протеинкиназу РАК-1, которая фосфорилирует виментин по Ser56.
Активность NADPH-цитохром Р-450-редуктазы в микросомальной фракции карциномы Герена крыс-опухоленосителей Кеца Оксана Виталиевна, Немиш В.В (Черновицкий национальный университет им. Ю.Федьковича, Украина, Черновцы, ksen808@mail.ru) В функционировании цитохром Р-450-зависимой микросомальной редокс-цепи большое значение имеет флавопротеид – NADPH-цитохром Р-450-редуктаза, изменение активности которого может привести к изменениям каталитической активности цитохрома Р-450.
Изучение функционирования компонентов биотрансформации лекарств опухолевой ткани на разных этапах онкогенеза открывает перспективы для выяснения механизмов резистентности опухоли к лекарственным препаратам.
Цель работы – исследовать активность NADPH-цитохром Р-450-редуктазы в микросомальной фракции карциномы Герена крыс на разных стадиях развития.
Исследования показали, что в период интенсивного роста карциномы Герена в микросомальной фракции активность NADPH-цитохром Р-450-редуктазы снижается в 2,раза в сравнении с исследуемыми показателями, характерными в латентный период роста карциномы. Уменьшение активности NADPH-цитохром Р-450-редуктазы снижает вероятность переноса электронов на цитохром Р-450, вследствие чего снижается роль последнего в метаболизме лекарственных препаратов в опухолевой ткани. С другой стороны, снижение ферментативной активности NADPH-цитохром Р-450-редуктазы и цитохрома Р-450 в опухолевой ткани может иметь протективное значение, поскольку их функционирование может не только инактивировать токсичные метаболиты, а наоборот, трансформировать их в соединения более опасные, чем исходные.
На терминальном этапе роста карциномы Герена наблюдается повышение активности NADPH-цитохром Р-450-редуктазы. Известно, что данный энзим владеет способностью самостоятельно катализировать некоторые оксигеназные и редуктазные реакции, принимать участие в реакциях перекисного окисления липидов (ПОЛ), поэтому повышение NADPHцитохром Р-450-редуктазной активности в опухолевой ткани может быть связано с участием данного фермента в интенсификации процессов ПОЛ, которые наблюдаются в ткани карциномы Герена в этот период онкогенеза.
Таким образом, в период интенсивного роста в организме карциномы Герена в микросомальной фракции наблюдается снижение активности NADPH-цитохром Р-450редуктазы. Активация фермента на терминальной стадии онкогенеза может быть обусловлена участие энзима в свободнорадикальных процессах клетки.
Изучение взаимодействия кардиотонических стероидов с Na,K-ATPазой Климанова Елизавета Андреевна (Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Россия, Москва, lehorsla@yandex.ru) За последние годы появилось множество работ, свидетельствующих о том, что помимо основной функции Na,K-ATPазы, связанной с поддержанием неравновесного распределения ионов Na+ и К+, данный фермент выступает в роли рецептора кардиотонических стероидов и за счет этого способен участвовать в регуляции пролиферации и смерти клеток. Разными группами исследователей были получены многочисленные данные о способности кардиотонических стероидов, помимо ингибирования Na,K-ATPазы, активировать сигнальные каскады клетки, включая рецепторы инозитол-3-фосфата, высвобождение внутриклеточного Са2+ и активных форм кислорода, Src-киназу, эпидермальный фактор роста (EGFR), протеинкиназу Ras, фосфоинозитол-3-киназу (PI3K) и митоген-активируемую протеинкиназу (MAPK) Erk 1/2. В связи с этим изучение взаимодействия кардиотонических стероидов с Na,K-ATPазой представляет интересную проблему.
Основываясь на данных о различии физиологических эффектов при взаимодействии разных кардиотонических стероидов (уабаина и маринобуфагенина) с Na,K-насосом, мы предполагаем существование разницы в параметрах подобных взаимодействий. В данной работе мы использовали почки кролика, из которых был получен очищенный препарат Na,KATPазы. Изучение взаимодействия полученного белка с КТС осуществляли посредством измерения флуоресценции ФИТЦ-меченных препаратов фермента, а также методом изотермической калориметрии титрования.
Изучение параметров взаимодействия уабаина с Na,K-ATPазой с помощью измерения изменений флуоресценции ФИТЦ-меченного белка и методом изометрической калориметрии титрования показало схожие результаты. Константа связывания примерно равна 1*105, а стехиометрия связывания, которую удалось установить с помощью калориметрии титрования, составила 0,3. Мы планируем изучить также параметры взаимодействия Na,K-ATPазы с маринобуфагенином, стероидом другой природы. Это позволит шире посмотреть на проблему ингибирования фермента кардиотоническими стероидами с последующей активацией сигнальных каскадов клетки, а также установить связь между параметрами взаимодействия КТС с Na,K-ATPазой и физиологическими эффектами.
Изменения внутриклеточного рН в гепатоцитах миноги (Lampetra fluviatilis L.) в период метаболической депрессии Коновалова Светлана Александровна (Институт эволюционной физиологии и биохимии им. Сеченова РАН, Россия, Санкт-Петербург, svetakonovalova@gmail.com) Гепатоциты миноги в последнюю зиму жизненного цикла, когда выключено экзогенное питание, представляют собой уникальную естественную модель для изучения процессов обратимой метаболической депрессии. Осенью, в самом начале миграции, гепатоциты метаболически активны, однако в результате длительного голодания развивается ярко выраженная метаболическая депрессия, которая весной, непосредственно перед нерестом, сменяется кратковременной активацией метаболизма.
Концентрация адениновых нуклеотидов была определена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, митохондриальный мембранный потенциал – на проточном цитометре и конфокальном микроскопе с помощью потенциал-зависимых флуоресцентных красителей (TMRM, DiOC6, JC-1 и MTG), а внутриклеточный рН - флюоресцентным красителем SNARF-1 AM.
Обнаружено, что в период с сентября по декабрь концентрация АТФ в кусочках печени миноги снижается с 0,8 до 0,2 нмоль/мг влажной массы, а энергетический заряд Аткинсона падает до критически низких значений – 0,2-0,3. Митохондриальный мембранный потенциал также снижается к зиме, достигая минимума в январе. Однако весной, начиная с марта, концентрация АТФ, заряд Аткинсона и митохондриальный потенциал возрастают, приближаясь к осенним значениям. При этом выявлены значительные сезонные изменения внутриклеточного рН гепатоцитов миноги. Зимой, величина внутриклеточного рН (рНi) на 0,3 единицы меньше, чем рН среды инкубации (рНe): pHi = 6,2 при pHe = 6,5 и pHi = 7,3 при pHe = 7,6. Закисления внутриклеточной среды в осенний и весенний периоды не происходит.
Таким образом, сезонные изменения рНi в гепатоцитах миноги хорошо коррелируют с энергетическим статусом клеток – зимой, когда концентрация ATP, энергетический заряд Аткинсона и митохондриальный мембранный потенциал минимальны, наблюдается закисление внутриклеточного пространства в гепатоцитах по сравнению с периодами метаболической активности (весна, осень). Известно, что при метаболической депрессии снижение рН является одним из наиболее эффективных способов защиты клетки от некроза.
Гистон Н1/ОБМ гидролизующие IgG как потенциальные маркеры в диагностике тяжести протекания системной красной волчанки Корний Наталья Сергеевна (Львовский национальный университет им. И.Я. Франко, Украина, Львов, aliakorniy@mail.ru) Антитела, обладающие способностью катализировать химические реакции, получили название каталитически активных антител, или абзимов. Наличие абзимов в сыворотке крови больных служит важным диагностическим показателем тяжести протекания различных аутоиммунных заболеваний. Нами впервые было установлено, что в сыворотке крови больных системной красной волчанкой (СКВ) присутствуют протеолитически активные IgG-антитела (протабзимы), обладающие способностью расщеплять гистон Н1 и основной белок миелина (ОБМ). Абзимы с подобной каталитической активностью не были обнаружены в сыворотке крови клинически здоровых людей.
В данной работе было решено установить взаимосвязь между протеолитической активностью IgG-антител сыворотки крови больных СКВ относительно гистона H1 и ОБМ и особенностями протекания этой болезни.
Было обследовано 38 больных на СКВ возрастом 13-71 года, из которых 34 (89,5%) – женщины. Диагноз СКВ был подтвержден клиническими и лабораторными данными, согласно критериям АСК (1997). IgG выделяли из сыворотки крови хроматографией на протеин G-сефарозе. Субстратами протеолитической реакции служили коммерческие препараты ОБМ и гистона Н1. Протеолитическую активность антител определяли электрофорезом в 12% ПААГ в присутствии 0,1% SDS.
Установлено, что 15 из 38 препаратов IgG (39,5%) у обследованных пациентов, больных СКВ, с разной эффективностью гидролизируют гистон Н1 и ОБМ. При этом, 14 из больных СКВ с обнаруженными в сыворотке крови протабзимами находились на стадии обострения болезни (93,3%).
Таким образом, протеолитическая активность IgG-антител сыворотки крови больных СКВ относительно гидролиза гистона Н1 и основного белка миелина коррелирует с обострением болезни и может служить важным маркером тяжести протекания этого заболевания.
Выделение и структурно-функциональная характеристика нового трехпетельного токсина из яда кобры Naja kaouthia Мещерякова Анна Владимировна (Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова РАН, Россия, Москва, iozefkneht@yandex.ru) Структурно-функциональная характеристика нейрорецепторов является важной задачей в связи с вовлеченностью этих рецепторов в патогенез нервных и психических заболеваний.
Так называемые трёхпетельные токсины змей за счет селективности действия являются незаменимыми инструментами в исследовании нейрорецепторов.
В нашей лаборатории путем поэтапной жидкостной хроматографии был выделен новый трёхпетельный токсин из яда кобры Naja kaouthia (Lesson,1831).
Сухой яд кобры разделяли на гель-фильтрационной колонке, после чего фракция vбыла обессолена и затем нанесена на катионообменную колонку, на которой исследуемый токсин в силу своей кислой природы не сорбировался. Последующее разделение включало в себя этапы обессоливания, анионообменной и обратнофазовой хроматографии.
Согласно данным масс-спектрометрии, масса выделенного токсина (а21.1) составляет 6845 Да. Его первичная структура имеет высокую степень гомологии (89-91% идентичных аминокислотных остаков) с последовательностями трехпетельных токсинов (ТПТ) группы ХХ (по классификации Fry, 2003), так называемых «орфанотоксинов», мишень действия которых на сегодняшний момент не определена.
Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.