WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 10 | 11 || 13 | 14 |   ...   | 83 |

Казанский (Приволжский) Федеральный университет, Россия Казань, biosensor@bk.ru В последнее время уделяется особое внимание исследованиям, направленным на объединение свойств живых клеток с уникальными свойствами биосовместимых наноматериалов для решения некоторых задач биотехнологии, биоэлектроники, экологии.

Целью данной работы явилась модификация клеточной поверхности водоросли Chlorella pyrenoidosa магнитными наночастицами для создания клеточных электрохимических биосенсоров.

В ходе работы были использованы одноклеточные зеленые водоросли Chlorella pyrenoidosa, которые часто используются в качестве чувствительного элемента биосенсоров.

Клеточную поверхность C. pyrenoidosa модифицировали магнитными наночастицами, которые были предварительно стабилизированы в процессе синтеза полиэлектролитом полиаллиламин гидрохлорида. Модифицированные клетки водорослей в дальнейшем были охарактеризованы различными методами микроскопии. При использовании просвечивающей электронной микроскопии было показано равномерное распределение иммобилизованных магнитных наночастиц на поверхности исследуемых клеток и их отсутствие в цитоплазме. При применении метода, который основан на автофлуоресценции водорослей, было установлено, что модифицированные клетки водорослей сохраняют свои физиологические функции.

В процессе создания биосенсора был использован новый подход к иммобилизации клеток на электрод: магнитно-модифицированные клетки C. pyrenoidosa наносились и удерживались на поверхности электрода при помощи магнита. Для детекции сигнала электрохимического сенсора использовали пробу на окисление-восстановлениие феррицианида при разных режимах освещенности для исследования фотосинтетической активности клеток водорослей. В опытах с триазиновыми гербицидами было продемонстрировано, что разрабатываемый биосенсор обладает хорошей воспроизводимостью и чувствительностью. Можно полагать, что такие биосенсоры могут быть применены для определения токсичных соединений в различных водоемах и сточных водах.

Intramolecular tautomerization and stability of Thy, Ura and its halogen derivatives Brovarets Olga Olexandrivna, Hovorun D M.

(Taras Shevchenko National University,Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, brovarets@list.ru, dhovorun@imbg.org.ua) 5-bromouracil and its analogues 5-chlorouracil and 5-fluorouracil are derivatives of uracil and classical mutagens, which mutagenic effect on DNA has been studied in detail for decades using molecular biological and genetic methods [2, 3].

Investigation of the mutagenic properties of these 5-halogenuracils is interesting and important due to the several reasons one of which is that noncanonical tautomeric or enol forms of Ura and its halogen derivatives were supposed to be very unstable, and their role in physiological DNA structures was assumed for years to be negligible. However, despite the fact that the presence of rare forms is only negligible, an increasing amount of data supports the importance of noncanonical tautomers in the mutations arising and stabilization of certain nucleic acid structures [2, 3].

In this paper using quantum-chemical methods of investigation on the MP2/6311++G(2df,pd)//B3LYP/6-311++G(d,p) level of theory the influence of the halogen derivatives of Ura on DNA replication and incorporation errors has been studied for the first time.

For the first time it has been established that the substitution of hydrogen atom at the Cposition of Ura for the halogen (Br, F, Cl) has practically no effect on the main physico-chemical characteristics of intramolecular tautomerization. At the same time, the energy of Ura tautomerization increases for 3.08 kcal/mol in comparison with corresponding value for Thy under standard conditions. Mutagenic action of the Ura halogen derivatives is not directly associated with their tautomerization.

The lifetime of the mutagenic tautomers of halogenuracils exceeds typical time of DNA replication in the cell (~103 s) by 3–10 orders. This fact confirms that the postulate on which the Watson-Crick tautomeric hypothesis of spontaneous transitions grounds, is adequate. The absence of intramolecular H-bonds in the canonical and mutagenic tautomeric forms determine their high stability.

ПОДСЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ» УСТНЫЕ ДОКЛАДЫ Роль нокаута гена pttg - 1 в развитии аутоимунних процессов у мышей Афанасьев Сергей Валериевич (Львовский национальный университет им. Ивана Франко, Украина, Львов, serhiy-aspirant@rambler.ru) Секурин (pituitary tumor transforming gene 1, PTTG) является регулятором расхождения хроматид в анафазе митоза, участвует в процессах репарации ДНК, апоптозе и регуляции дифференциальной экспрессии генов. У мышей с нокаутом гена pttg-1 (PTTG-KO) наблюдается гиперплазия тимуса, гипоплазия селезенки и яичек.

В данной работе было решено определить влияние отсутствия гена pttg на синтез моноспецифических антител и исследовать их афинность, а также провести исследование возможного влияния отсутствия гена pttg-1 на возникновение аутоиммунных процессов.

Нами было показано, что нокаут гена pttg-1 приводит к нарушению регуляции продукции антител в ответ на введение антигена. Мышей иммунизировали суспензией эритроцитов человека. Забор крови для выявления антиэритроцитарных антител проводили на 14 и 21 день после иммунизации. Определение уровня антител проводили методом иммуноферментного анализа. У мышей дикого типа (PTTG-WT) наблюдался пик роста количества антиэритроцитарных антител на 14 день и уменьшение количества антител на день. У PTTG-KO мышей рост уровня антиэритроцитарных антител наблюдался как на 14, так и на 21 день. Исследование аффинности антиэритроцитарных антител показало, что антитела, полученные из иммунизированных PTTG-KO мышей, имеют более низкую аффинность по сравнению с антителами, полученными из крови мышей дикого типа.

У PTTG-KO мышей был обнаружен высокий уровень аутоантител к двухцепочечной ДНК, тогда как уровень антител, специфических к одноцепочечной ДНК, оставался без изменений. Исследование аффинности антител к нативной ДНК показало, что рост уровня анти-ДНК аутоантител в PTTG-KO мышей, вероятно, вызван ростом уровня антител с низкой аффинностью в то время, как титр антител с высокой аффинностью оставался без изменений как в PTTG-KO, так и у мышей дикого типа. Следовательно, нокаут гена pttg-приводит к нарушению регуляции продукции антител в ответ на стимуляцию антигеном.

Наличие высокого уровня аутоантител к двухцепочечной ДНК свидетельствует о развитии аутоиммунных процессов у PTTG-KO мышей.

Получение и изучение защитного пептида ежовника Echinochloa crus-galli Беркут Антонина Анатольевна, Опарин П. Б., Василевский А. А.

(Московский физико-технический институт и институт биоорганической химии им.

академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Россия, Москва, AntoninaBerkut@gmail.com) В последнее время в медицине и сельском хозяйстве сложилась острая ситуация, связанная с развитием у патогенных бактерий и грибов устойчивости к соединениям, использующихся для подавления их роста. Вследствие этого, возникает потребность в препаратах нового поколения: для аграрной промышленности необходимо создание эффективных фунгицидов, для медицины – антибиотиков. Кандидатами для разработки новых пестицидов и антибиотиков являются защитные пептиды растений, в частности, представители группы т.н. «четырехцистеиновых» (4Cys) пептидов. Отличительными особенностями этих соединений служат: наличие в их составе двух консервативных мотивов Cys-X3-Cys, где X – любой аминокислотный остаток, а также характерная пространственная укладка, представленная двумя -спиралями, стабилизированными двумя дисульфидными мостиками.

Объектом представленной работы является пептид Ес-AMP-1 из ежовника Echinochloa crus-galli. Он принадлежит к группе 4Cys пептидов и обладает антифунгальной активностью. Целью работы было получение рекомбинантного пептида Eс-AMP-1 для проведения структурно-функциональных исследований. В ходе работы была синтезирована кДНК целевого пептида, которая затем была введена в состав бактериального экспрессионного вектора. Полученная конструкция была использована для трансформации клеток Escherichia coli. Далее проводилась контролируемая экспрессия гена целевого продукта. После лизиса клеток полученный лизат подвергали аффинной хроматографии, в результате чего был очищен химерный белок, состоящий из Ес-AMP-1, линкерного участка и белка-помощника тиоредоксина. Целевой пептид был получен после гидролиза гибридного белка и разделения продуктов методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Выход пептида составил 11 мг с 1 л бактериальной культуры.

Затем было проведено тестирование антифунгальной активности рекомбинантного пептида, которое показало, что Eс-AMP-1 в микромолярных концентрациях обладает способностью подавлять рост ряда фитопатогенных грибов.

Выделение и изучение некоторых свойств “химер”, состоящих из малых белков теплового шока человека и флуоресцентных белков Дацкевич Петр Николаевич, Мымриков Е.В.

(Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Россия, Москва, datsbio@gmail.com) Малые белки теплового шока человека (sHSP) – представители распространенного семейства белков, участвующих в поддержании гомеостаза в нормальных и стрессовых условиях. Они вовлечены в регуляцию разнообразных процессов в клетке, например, апоптоза, пролиферации, сворачивания и деградации белков, препятствуют агрегации денатурированных белков. Мутации этих белков зачастую коррелируют с развитием онкологических и нейродегенеративных заболеваний человека.

Использование “химер”, состоящих из исследуемого и флуоресцентного белка (FP), позволяет анализировать внутриклеточную локализацию и функционирование белков в живой клетке. Однако такой популярный подход возможен только в случае, если FP не влияет на свойства исследуемого белка.

Целью данной работы была разработка метода получения и изучение некоторых свойств “химер”, состоящих из малых белков теплового шока человека HSPB1, HSPB5, HSPB6 и HSPB8 и цианового или желтого флуоресцентных белков. Рекомбинантные химерные белки экспрессировали в клетках E.coli штамма BL21. В ходе работы подобраны составы сред, температура и время культивирования, обеспечивающие высокие уровни экспрессии “химер”. Разработан метод выделения, состоящий из фракционирования сульфатом аммония, ионообменной хроматографии и гель-фильтрации, позволяющий получать гомогенные препараты химерных белков с выходом, достигающим 40-60 мг из 1 л среды культивирования. Получены очищенные препараты 8 химерных белков.

Методом гель-фильтрации исследовано олигомерное состояние полученных белков.

Установлено, что “химеры” FP-HSPB1 и FP-HSPB5 образуют олигомеры меньшего размера, чем немодифицированные HSPB1 и HSPB5. В то же время размеры олигомерных комплексов, формируемых “химерами” FP-HSPB6 и FP-HSPB8 не отличаются от размеров олигомерных комплексов, образуемых белками дикого типа. Таким образом, включение флуоресцентного белка в состав “химер” может оказывать существенное влияние на свойства sHSP. В этой связи требуются дополнительные исследования для установления приемлемости указанных “химер” для изучения sHSP в живой клетке.

Авторы благодарны Н.Н. Случанко и А.А. Шеметову за получение молекулярнобиологических конструкций. Работа выполнена при поддержке фонда РФФИ (10-04-00026) Изучение апоптоз-индуцирующей активности моноклональных антител к опухолевому ганглиозиду GDДоронин Игорь Игоревич (Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А.

Овчинникова РАН, Российская федерация, Москва, doroninii@gmail.com) Исследования последних лет показали, что некоторые ганглиозиды, гиперэкспрессируемые определенными видами опухолей, включая нейробластомы, глиомы, меланомы, мелкоклеточные опухоли легких, являются удобными мишенями для разработки иммунотерапевтических подходов лечения данных заболеваний. Однако в данных исследованиях собственная функциональная роль ганглиозидов практически не изучена.

Представленная работа направлена на изучение молекулярных механизмов апоптоза и его роли в противоопухолевой активности моноклональных антител к опухолеспецифичному ганглиозиду GD2.

На данном этапе работы были наработаны моноклональные антитела ME361 к ганглиозиду GD2 из культуральной среды гибридомы HB9326. Показано, что выделенные антитела представляют собой высокоочищенную фракцию иммуноглобулинов, обладающих высокой специфичностью к ганглиозиду GD2, что было проверено при помощи биохимических методов, а также методов проточной цитофлуориметрии и конфокальной микроскопии.

В качестве клеточной модели исследования эффектов моноклональных антител MEвыбрана мышиная Т-клеточная лимфома EL-4, которая экспрессирует высокий уровень ганглиозида GD2. Проведен анализ апоптоз-индуцирующей активности данных антител, а также определено участие белков, значимых для проведения апоптоза с использованием ингибиторного анализа и метода ПЦР.

В результате нашей работы показано, что GD2-специфические антитела вызывают дозозависимую супрессию пролиферации клеток лимфомы EL-4. Клеточная гибель, вызываемая GD2-специфическими антителами, проходит по механизму апоптоза. Процесс апоптоза, запускаемый GD2-специфическими антителами, протекает по классическому рецептор-опосредованному механизму, в который включены инициаторные и исполняющие каспазы. Использование Fab и F(ab’)2 фрагментов показало, что бивалентность антител не играет существенной роли в процессе запуска апоптоза, так как Fab фрагменты антител обладают высокой апоптоз-индуцирующей активностью. Исходя из данных конфокальной микроскопии и проточной цитофлуориметрии, можно заключить, что запуск процесса апоптоза опосредован изменениями, происходящими в липидных доменах плазматических мембран клеток.

Работа выполнена при поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., государственный контракт №П1065.

Сравнительная характеристика основных биохимических свойств нормальной (М1-) и опухолевой (Tu-) пируваткиназы Исачкин Олег Викторович (Белорусский государственный университет, Биологический факультет, Республика Беларусь, Минск, fep_888@tut.by) Пируваткиназа (ПК, АТФ: пируват-фосфотрансфераза, КФ 2.7.1.40) – важнейший гликолитический фермент, участвующий в реакции субстратного фосфорилирования АДФ.

В организме человека фермент представлен 4 изоформами, различающимися по особенностям регуляции биокатализа, ферментативной активности и локализации в тканях.

Pages:     | 1 |   ...   | 10 | 11 || 13 | 14 |   ...   | 83 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.