WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

В настоящее время большая часть исследовательских работ и проведение гастроэнтерологической диагностики на основе анализа изотопного соотношения углерода в выдыхаемой двуокиси углерода осуществляются с применением масс-спектрометрических методов. Серийно производимые массспектрометры, специализированные на проведение уреазного дыхательного теста (BreathMAT, Finnigan MAT, Германия), достаточно дороги, что сдерживает широкое распространение изотопных методов диагностики в практической медицине. На сегодня в России имеется только два прибора BreathMAT, находящиеся в клиниках г. Москвы [www.textronica.com]. Между тем многие российские научно-исследовательские центры и организации оснащены изотопными масс-спктрометрами для измерений соотношения стабильных изотопов в газовой фазе. Использование этой техники и проведение совместных работ со специалистами в области гастроэнтерологии и гепатологии дает на сегодня реальную возможность широкого практического освоения изотопных дыхательных тестов и проведения клинико-диагностических исследований, основанных на использовании препаратов, меченых стабильными изотопами.

В данной работе продемонстрированы результаты практической реализации уреазного дыхательного теста с использованием стандартного изотопного масс-спектрометра в комплектации с двухканальной системой напуска. Представлена методика подготовки проб выдыхаемого воздуха для масс-спектрометрического измерения изотопного состава выдыхаемой Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 1492 htttp://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/126.pdf углекислоты. Приведены результаты диагностирования HР- инфекции для тестируемых.

Уреазный дыхательный тест. К 1994 г. было официально признано, что инфицированность человека бактериями Helicobacter pylori (НР) является одной из основных причин возникновения гастритов и язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки [23, 24, 25]. Известны биохимические, эндоскопические, иммунологические, микробиологические, изотопные методы диагностики НР-инфекции. В настоящее время предпочтение отдается неинвазивному 13С-уреазному дыхательному тесту, обладающему высокой диагностической достоверностью. Впервые тест был разработан в 1987г. Д.

Грахамом [11]. Диагностическим критерием хеликобактериоза является оценка степени обогащения изотопом углерода 13С выдыхаемого СО2 при наличии уреазной активности в желудке после перорально принятой дозы мочевины, обогащенной стабильным изотопом 13С углерода.

В сравнении с традиционными методами диагностики, дыхательный тест наиболее привлекателен, так как прост в исполнении, не инвазивен, безопасен для здоровья, достоверность результатов близка к 100%.

Схематически тест можно представить следующим образом:

Уреаза Изотопный бактерий СО2-Выдох СО2 СО(NH ) NH +3 анализ СО Для выполнения теста достаточно взять у пациента одну контрольную пробу выдыхаемого воздуха до приема обогащенной мочевины и одну пробу выдыхаемого воздуха спустя 30 минут после приема мочевины. Если есть инфицирование Helicobacter pylori бактериями, то энзим уреаза, находящийся на поверхности бактериальной клетки, расщепляет мочевину до аммиака и углекислого газа. Образованный таким образом СО2, имеет обогащение изотопом 13С. Продукты распада, проходя по пищевому тракту, всасываются в кровь, из крови в легкие и частично уходят в виде СО2 с выдыхаемом воздухом.

В этом случае, соотношение изотопов углерода в выдыхаемом углекислом газе изменится по сравнению с пробой, отобранной непосредственно перед приемом мочевины. Присутствие изотопа углерода 13С в выдохе выше принятого контрольного уровня является показателем инфицированности (положительный Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 1493 htttp://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/126.pdf результат теста). Если бактерий Helicobacter pylori в организме нет, мочевина проходит пищеварительный тракт без разложения и практически не влияет на соотношение изотопов углерода в выдыхаемом воздухе (отрицательный результат теста). Определение величины контрольного уровня для разделения между положительным и отрицательным результатами теста чрезвычайно важно. Величина контрольного уровня определена эмпирически по результатам сравнительного анализа данных дыхательного теста с данными эндоскопии. В результате многочисленных исследований определено значение контрольного уровня в 5‰ [26, 10]. Значение контрольного уровня не зависит от возраста тестируемого и имеет универсальное применение к любым категориям пациентов.

Высокая точность и чувствительность дыхательного теста позволяет определять степень инфицированности НР и выявлять его малые колонизации (интегральные данные по всему желудку). Осуществлять контроль эрадикации после курса терапии, но не раньше, чем через 28 дней после прекращения приема антихеликобактерных и антисекреторных средств.

Аналитическая процедура измерения 13С выдоха.

Аналитическая процедура измерения изотопного состава углерода СОвыдоха включает в следующие позиции.

I. Сбор образца выдыхаемого воздуха в стеклянный пробоотборник.

II. Подготовка образцов к масс-спектрометрическому анализу: криогенное разделение в вакууме СО2 выдоха от других выдыхаемых газов (азот, кислород, вода и др.).

III. Измерение изотопного состава 13С СО2 выдоха на масс-спектрометре.

I. Пробы выдыхаемого воздуха собирают и хранят в стеклянной емкости рис.1. Полный выдох производят в емкость через стеклянную трубку с вентилем. После выдоха вентили 1 и 2 закрывают. Вакуумное уплотнение вентилей исключает обмен образца СО2-выдоха с атмосферной СО2. Образцы выдоха могут храниться длительное время (более 10 суток).

Выдох ВентильВентильЭлектронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 1494 htttp://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/126.pdf рис.1 Емкость для сбора и хранения образца выдыхаемого воздуха.

II Подготовка образцов СО2 выдоха к масс-спектрометрическому анализу была выполнена на вакуумной установке рис.2. Установка включает следующие элементы: систему откачки до 10-5 мм.рт.ст.; датчики высокого давления; Vобразную ловушку для разделения газовой смеси; вентиль с емкостью для вымораживания чистого СО2. Все элементы установки выполнены из стекла и соединены между собой с помощью вакуумных переходников. Емкость с образцом выдоха подсоединяют через переходник к вакуумной линии. Во всей системе, исключая емкость с образцом, создают давление 10-5 мм.рт.ст. После чего закрывают от системы откачки вакуумную линию и открывают емкость с образцом, распуская газ в V-образную ловушку. Вентиль между ловушкой и емкостью закрывают, замораживают ловушку жидким азотом (-1960С) и подключают к откачке. В процессе откачки азот и кислород полностью удаляются из системы, СО2 и Н2О, имеющие низкое парциальное давление при данной температуре, остаются замороженными на стенках ловушки. После откачки ловушку термостатируют -(7080)0С при помощи охлажденного азотом спирта, СО2 полностью переходит в газовую фазу, а вода остается замороженной. Чистый СО2 собирают в емкость и подают на массспектрометрическе измерение 13С. Вся процедура подготовки занимает 5-минут.

Вакуум датчик Вентиль Рис.2 Схема вакуумной установки для подготовки Откачка Ввод для выдыхаемого углекислого газа к на вакуум емкости с образцом масс-спектрометрическому изотопному анализу.

емкость оС -для СО III Измерения изотопного состава СО2 выдоха были проведены на массспектрометре Finnigan MAT, Бремен, Германия, модель МАТ 252. Измерения проведены относительным методом с использованием стандартной двойной системы напуска изотопов. Измерения проведены относительно рабочего стандартного газа СО2, откалиброванного по международным Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 1495 htttp://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/126.pdf сертифицированным стандартам NBS19, NBS18, IAEA-CO-8. Результаты измерения 13С СО2-выдоха представлены относительно международного стандарта VPDB.

Результаты исследований Проведена серия экспериментов по реализации уреазного дыхательного теста на оборудовании лаборатории стабильных изотопов ДВГИ ДВО РАН. В тестировании принимало участие пациентов (мужчин – 7, женщин – 4, средний возраст 42±17 лет) с диагнозом хронического гастрита ассоциированного с Helicobacter pylori. Диагноз хронического гастрита поставлен на основе фиброгастродуоденоскопического исследования, морфологического изучения биоптатов слизистой и диагностики НР-инфекции с применением быстрого уреазного (CLO) теста. Обследование пациентов проведено на базе городской клинической больницы №г.Владивостока. Для эрадикации Helicobacter pylori была использована схема трехкомпонентной терапии, рассчитанной на 14 дней.

С-уреазный дыхательный тест был проведен согласно общепринятому протоколу [9, 10] в следующей последовательности.

Отбор пробы выдыхаемого воздуха до приема меченого препарата (базовая проба). Прием пациентом дозы 13С-мочевины, растворенной в 100 мл воды или сока. Отбор пробы выдыхаемого воздуха через 30 минут после приема меченого препарата (контрольная проба).

Сбор проб поизводится в стеклянные емкости с герметичным уплотнением.

Для этого тестируемый делает глубокий вдох, задерживает дыхание на секунд, делает полный выдох через трубку в емкость и герметично ее закрывает. Отобранные пробы поступают на изотопный анализ в течение первых суток.

Для выполнения теста использована мочевина, с обогащением 13С (99.атомн. %), изготовитель ISOTEC Inc. A Matheson, USA Company, сертификат соответствия получен в лаборатории экотоксикологии Института проблем экологии и эволюции РАН. Применяемая доза 13С-мочевины определена из расчета 1мг препарата на 1 кг массы тела [26, 27, 28]. Изменение изотопного состава 13С СО2 выдоха между базовым и контрольным значениями более чем на 5‰ принято за положительный результат теста [26, 10].

Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 1496 htttp://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/126.pdf С-уреазный дыхательный тест был применен к испытуемой группе пациенов до лечения хеликобактериоза и спустя 1 месяц после терапии ( в одном случае срок между окончанием лечения и тестированием составил месяцев).

Данные изотопных анализов, полученные при тестировании пациентов до лечения, сведены в табл. 1. Показаны две серии результатов 13С-уреазного дыхательного теста. Первая серия содержит данные первичного обследования пациентов (тест1), вторая серия – данные, полученные через 10 дней при повторном обследовании этих пациентов (тест 2). Между тестами лечение не проводилось.

Таблица 1. Результаты изотопных анализов 13С-уреазного дыхательного теста у Helicobacter pylori-инфицированных пациентов до проведения эрадикации Тест 1 Тест № Базовый Контрольный (контрольный Базовый Контрольны (контрольный паци- анализ анализ - базовый) анализ й анализ - базовый) ента 13СPDB, ‰ 13СPDB, ‰ 13С, ‰ 13СPDB, ‰ 13СPDB, ‰ 13С, ‰ 1 -24.7 -16.9 7.8 -23.5 -16.2 7.2 -23.2 -9.1 14.1 -23.4 -9.7 13.3 -23.6 -12.5 11.1 -24.0 -10.8 13.4 -23.1 -12.9 10.2 -22.9 -10.7 12.5 -24.1 -12.1 12.0 -23.2 -12.3 10.6 -22.2 -10.1 12.1 -22.3 -7.2 15.7 -23.0 -10.1 12.9 -23.3 -9.0 14.8 -23.6 2.3 25.9 -24.0 -0.2 23.10 -22.1 -2.7 19.Анализ изотопного отношения углерода выдыхаемого воздуха (тест 1) показывает, что у всех пациентов разница между измеренным значением 13С СО2-выдоха до и после приема 13С-мочевины (13С) превышает контрольный уровень в 5‰. Максимальная разность 13С СО2 выдоха между базовым и контрольным значениями у пациентов в данной серии составила 25.9‰, минимальная 7.8‰. Полученные данные можно оценивать как положительный результат теста, что полностью согласуется с результатами гастроскопических и морфологических исследований. Различие значений 13С-обогащения СО2 в выдохе между отдельными пациентами отражает разную степень бактериального инфицирования этих пациентов. Группа пациентов у которых наблюдалось сравнительно небольшое увеличение содержания 13СО2 в контрольной пробе была протестирована повторно (тест 2). Сравнение Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 1497 htttp://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/126.pdf результатов теста 1 и 2 показало небольшие вариации изотопного отношения углерода в выдыхаемом воздухе. Максимальное отклонение величины 13С теста 1 от соответствующего значения теста 2 составляет 3.0‰, минимальное 0.4‰. Наблюдаемые вариации обусловлены изменением 13С метаболического СО2 и естественными колебаниями размеров колонизации Helicobacter pylori. В целом, данные тестирований 1 и 2 показывают близкое совпадение, свидетельствуя о высокой достоверности получаемых результатов.

Данные изотопных анализов, полученные при тестировании испытуемой группы пациентов после эрадикационной терапии, сведены в табл. 2. Десять пациентов были протестированы через 1 месяц по завершению терапевтического курса и 1 пациент – через 12 месяцев. В первом случае у 8-и пациентов результаты тестирования показали, что разница между измеренным значением 13С СО2 выдоха до и после приема 13С-мочевины не превышает контрольный уровень. Максимальное отклонение контрольного значения 13С от базового составило 1.4‰. Эти данные можно оценивать как отрицательный результат теста. Для двух пациентов получен положительный результат. У одного из них 13С составила 6.8 ‰ (табл.2, №9), что на 17‰ меньше соответствующего результата, полученного до лечения (табл.1, №9). У другого пациента 13С составила 16.3‰ (табл.2, №10), в сравнении с результатом до лечения (табл.1, №10), снижение составило 3.1‰. Для пациента, прошедшего тестирование через 12 месяцев после окончания лечения (табл.2, №11), результат оказался отрицательный. Полученные данные позволяют контролировать эффективность применяемой антибактериальной терапии надежным не инвазивным методом.

Pages:     | 1 || 3 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.