WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |
Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 1485 htttp://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/126.pdf 13 С-уреазный дыхательный тест на базе прецизионной изотопной масс-спектрометрии Веливецкая Т.А. (Velivetskaya@mail.ru), Игнатьев А.В.

Дальневосточный геологический институт ДВО РАН Введение. В настоящее время интенсивно развивающиеся изотопные методы получили общее признание в области научной и практической медицины. Многие современные методы клинической диагностики и фармологических исследований основаны на применении меченых изотопов. Использование меченых изотопов является в отдельных случаях единственно возможным методом экспериментального исследования проблем, связанных с изучением динамики процессов и путей превращения химических веществ в живом организме. До недавних пор, исследование ряда механизмов функционирования различных органов и систем проводилось в основном с применением радиоактивных изотопов водорода, углерода, фосфора, калия и других элементов. Высокая чувствительность и точность радиоактивных измерений позволяют применять малые количества радиоактивных изотопов. Тем не менее, радиационное воздействие на организм является источником потенциального риска для здоровья человека.

Радиационное воздействие недопустимо в диагностических процедурах для беременных женщин, младенцев и детей. В последние годы значительное внимание уделяется методам с применением стабильных изотопов.

Преимущество использования стабильных изотопов вполне очевидно – это их полная безопасность, они не радиоактивны и не токсичны [1, 2]. Интенсивное внедрение методов стабильных изотопов в практическую медицину стимулировано высоким уровнем современного развития и совершенствования изотопной масс-спектрометрической техники для измерения стабильных изотопов и развитием технологий по производству препаратов, обогащенных стабильными изотопами. Благодаря высокому уровню чувствительности современной аналитической техники для проведения клинических исследований достаточно очень малого количества препарата, меченного стабильными изотопами. Применяемые дозы препаратов сопоставимы по Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 1486 htttp://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/126.pdf содержанию стабильных изотопов с поступлением их в организм естественным путем вместе с пищей, водой, воздухом [3]. Кроме того, стабильные изотопы имеют еще одно немаловажное преимущество перед радиоактивными изотопами. Время жизни радиоактивных изотопов мало, по сравнению с некоторыми биологическими процессами протекающими в организме (период полураспада азота –10 мин, кислорода – 124 с), поэтому использовать их в качестве трассеров очень сложно. С помощью стабильных изотопов кислорода [4], азота [5] и др., возможно изучать длительные во времени процессы, дифференцировать механизмы различных превращений веществ в организме, динамику метаболических процессов, распад и синтез различных соединений, участвующих в непрерывном химическом взаимодействии.

Уникальные возможности методов стабильных изотопов позволяют проводить диагностические исследования с высокой достоверностью и получать количественные данные с необходимой точностью, что выгодно отличает их от традиционных методов медицины. В частности, это касается диагностики экзокринной недостаточности поджелудочной железы и последующей коррекции энзимного обмена [6], определения энзимной функции печени [7], активности окисления жирных кислот [8], диагностики заболеваний желудка, тонкой и толстой кишки [9, 10]. В настоящее время существует более 20 видов изотопно обогащенных препаратов, применяемых в диагностике различных заболеваний человека. Препараты имеют в качестве метки природные стабильные изотопы различных элементов - водород, углерод, азот, кислород.

Применяемые в диагностических методах дозировки различных изотопномеченых препаратов безопасны для здоровья.

В последние годы разработан новый метод диагностики инфицированности человека бактериями Helicobacter pylori [11]. Наличие бактерий диагностируют с помощью вещества (мочевина), обогащенного изотопом 13С. Фермент уреаза, вырабатываемый бактериями Helicobacter pylori, катализирует гидролиз мочевины до СО2, NH3 и Н2О. В результате разложения С-обогащенной мочевины и последующего метаболизма, выдыхаемый углекислый газ обогащается тяжелым изотопом углерода. Оценка степени 13Собогащения СО2 позволяет диагностировать степень инфицированности.

Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 1487 htttp://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/126.pdf Стабильные изотопы углерода и их измерение.

1. Стабильные изотопы. Одним из наиболее распространенных и важнейших элементов биосферы является углерод. Углерод имеет два стабильных изотопа с массовым числом 12 (12С) и массовым числом 13 (13С). В природе средняя распространенность 12С составляет 98,89%, распространенность 13С составляет 1,11%. В среднем природное изотопное отношение 13С/12Ссоставляет 0,011. Распространенность стабильных изотопов не является постоянной величиной и имеет вариации в различных природных объектах. Вариации возникают вследствие перераспределения (фракционирования) изотопов в результате физических, химических и биологических процессов. Причиной фракционирования является различие изотопов по массам. Различие изотопов по массам обуславливает различие термодинамических свойств молекул, в состав которых входят различные изотопы элементов [12]. Например, связи, образованные легким изотопом, менее прочны и поэтому молекула, содержащая легкий изотоп, более реакционно способна по отношению к аналогичной молекуле, имеющей в своей структуре тяжелый изотоп [13,14]. В результате процессов фракционирования вещества могут обогащаться в разной степени легким изотопом или тяжелым изотопом. Например, растения С4 типа (травы пустынь) имеют обогащение тяжелым изотопом углерода в большей степени, чем растения С3 типа (травы умеренной климатической зоны) [15]. Обогащение обусловлено кинетическим фракционированием изотопов углерода в процессе фотосинтеза и зависит от механизма фотосинтеза.

Помимо фракционирования, соотношение изотопов в веществе зависит от соотношения изотопов в источнике, из которого образуется вещество. При формировании вещество получает изотопную метку своего источника.

Например, содержание 13С изотопа в организме человека определяется поступлением 13С-изотопно обогащенных веществ вместе с пищей.

Естественное обогащение организма тяжелым изотопом углерода происходит в результате потребления С4-типа растительной пищи с высоким содержанием изотопа 13С. Потребление С3-типа растительной пищи приводит к меньшей степени содержания тяжелого изотопа углерода в организме человека.

Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 1488 htttp://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/126.pdf Соотношение изотопов углерода выдыхаемого СО2 зависит от преобладания Сили С4 растительной пищи в диете. Содержание 13С изотопа углерода в организме можно оценить по изотопному составу углекислого газа в выдыхаемом воздухе. Естественное, природное соотношение изотопов углерода выдыхаемого СО2 варьирует в диапазоне (1.10 – 1.08)% [16]. Это соотношение может быть изменено, если поступающие в организм вещества имеют изотопное обогащение значительно отличающееся по величине от природного.

Препараты с высокой степенью обогащения стабильными изотопами получают искусственным путем. Так, например, в дыхательном тесте для диагностики инфицированности Helicobacter pylori применяют мочевину, обогащенную 13С изотопом. Величина 13С-обогащения выдоха зависит от дозы и степени изотопного обогащения принимаемого препарата, а также от величины метаболического продуцирования 13СО2. В присутствии бактерий мочевина разлагается с выделением изотопно обогащенного углекислого газа.

Образование изотопно меченого СО2 является индикатором процесса разложения мочевины, а значит и присутствия Helicobacter pylori бактерий в организме человека.

2. Измерение изотопов. Для определения отношения изотопов в образце (изотопный анализ) необходимы надежные методы и аналитическая техника с высокой чувствительностью и точностью измерения. В настоящее время анализ стабильных изотопов может быть выполнен масс-спектрометрическим методом или спектрофотометрическими методами. Современные масс-спектрометры позволяют измерять изотопное отношение 13С/12С с точностью 10-8 %.

На практике результаты измерения изотопного состава представляют с помощью величины, которая измеряется в промилле.

= {(Rобразца / Rстандарта) – 1}хгде Rобразца –относительное содержание тяжелого и легкого изотопа в образце, Rстандарта - относительное содержание тяжелого и легкого изотопа в стандарте.

Следовательно, при измерении изотопов имеют дело не с абсолютными величинами их отношений, а с относительными отклонениями от изотопного состава стандартного образца. Положительные значения указывают на большее содержание тяжелого изотопа углерода в образце относительно Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 1489 htttp://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/126.pdf стандарта, а отрицательные значения на обеднение образца тяжелым изотопом по сравнению со стандартом.

Общепринятым международным стандартом для изотопного анализа углерода является стандарт PDB – кальцит окаменелости Belemnitella americana мелового возраста из Южной Каролины. Абсолютное значение 13С/12С отношения в этом стандарте было установлено Крейгом и равно 0.0112372 ат.% [17]. Со временем этот стандартный материал был исчерпан. Американским национальным бюро стандартов предложен новый стандарт (морской известняк) NBS19, величина 13С которого была точно установлена относительно PDB в ряде лабораторий. Основываясь на этих определениях, Международное агенство по атомной энергии в 1983г. ввело новую шкалу - VPDB. С этого момента изотопный состав углерода образца принято сообщать относительно VPDB.

Масс-спектрометрический метод является на сегодня основным, применительно к дыхательным тестам на основе изотопно меченых препаратов. Изотопный анализ СО2 выдыхаемого воздуха этим методом требует предварительной подготовки образца выдоха: разделение СО2 от других газовых компонентов в выдохе. Разделение может быть выполнено с применением криогенной системы очистки, или методом газовой хроматографии. Первую систему пробоподготовки применяют в комбинации с двухканальной системой напуска газа в масс-спектрометр, отношение 13С/12С в образце и стандартном газе измеряют последовательно в цикле из 10 раз. Хроматографический способ разделения используют в сочетании с подключением к масс-спектрометру интерфейса СonFlo, регистрацию 13СО2 в образце и стандарте проводят однократно. Сравнительный анализ измерения выдыхаемого 13СО2 этими способами показывает точность определения 13С-обогащенности СО2 <0.02‰ для двухканальной системы напуска газа в масс-спектрометр и <0.14‰ с применением СonFlo интерфейса [18]. Применительно к дыхательным тестам требования к аналитическим характеристикам измерительной аппаратуры не столь высоки, удовлетворительная точность измерения изотопного отношения углерода в выдыхаемом воздухе составляет 0.5‰. Этому условию отвечает специализированный прибор BreathMAT (производства Finnigan МАТ, Германия), широко используемый на практике для проведения дыхательных Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 1490 htttp://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/126.pdf тестов. Прибор включает в себя систему автоматической подачи и напуска газа для последовательного измерения порядка 200 образцов, систему пробоподготовки образцов методом хроматографии, масс-спектрометрический детектор, систему управления прибором и обработки данных. Прибор обеспечивает высокую производительность и достоверность результатов анализа.

Cпектрофотометрические методы измерения изотопного состава являются альтернативными масс-спектрометрии. В отличие от массспектрометрии, оптические методы анализа детектируют поглощение электоромагнитных волн молекулами в инфракрасной (ИК) области спектра.

Аналитическая техника, основанная на методах молекулярной спектроскопии, существенно дешевле изотопных масс-спектрометров, но уступает в точности измерения изотопного состава. Использование ИК-спектрометров в медицинской диагностике, с применением меченых 13С-изотопом препаратов, позволило удешевить и упростить реализацию уреазных дыхательных тестов.

Клинические испытания ИК-спектрометрической техники для диагностики Helicobacter pylori инфекции и сравнительный анализ полученных данных с масс-спектрометрическими (МС) исследованиями показывают близкую корреляцию между соответствующими данными тестов [19], что отражает равноправность применения ИК и МС техники для определения инфицированности пациентов Helicobacter pylori.

Повышение точности изотопного анализа спектральных методов возможно при использовании лазеров с перестраиваемой частотой. Высокая монохроматичность и мощность лазерного излучения позволяет определять форму спектральных линий с высоким разрешением, повышает чувствительность и точность регистрации спектров. Применительно к диагностике Helicobacter pylori инфекции использование лазерной спектрометрической техники повышает точность изотопного анализа и расширяет диагностические возможности спектральных методов. В частности, применение перестраиваемых диодных лазеров, как источника ИК-излучения, обеспечивает оптимальные условия частоты и мощности излучения лазера для одновременной регистрации линий поглощения молекулами 12СО2 и 13СО2 с высоким разрешением, что технически упрощает спектральный анализ и Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 1491 htttp://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/126.pdf повышает точность определения изотопного отношения углерода в исследуемой газовой среде [20]. Интенсивное развитие методов лазерной спектроскопии способствует созданию аналитических приборов для медицинской диагностики более доступных по цене и удобных в эксплуатации. Анализ данных клинической апробации 13С-уреазного дыхательного теста на основе диодной лазерной спектроскопии показывает достаточно надежные результаты диагностики инфицированности Helicobacter pylori, позволяет определять степень колонизации бактерии и контролировать эффективность применяемой терапии [21, 22]. Данные лазерной диагностики хорошо коррелируют с результатами масс-спектрометрии.

Pages:     || 2 | 3 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.