WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 ||

Из рН-зависимостей lgkcat/Km для о-дианизидина и гидрохинона видно, что формы кривых имеют сложную зависимость, затрудняющие определение природы ионогенных групп нативного фермента, принимающих участие в катализе этих субстратов (рис. 4). По-видимому, ионогенные группы, принимающие участие в каталитическом процессе пероксидазы, находятся в окружении гидрофобных аминокислотных остатков, что проявляется в затруднении определения рКа этих Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 928 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/081.pdf lgkcat/Km pH Рис. 4. рН-Зависимости lg(kcat/Km) для реакций пероксидазного окисления одианизидина (1) и гидрохинона (2).

Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 929 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/081.pdf функциональных групп на рН-зависимостях каталитических констант реакций пероксидазного окисления о-дианизидина и гидрохинона. Поскольку сами субстраты содержат функциональные группы с высокими значениями рКа и в исследованном диапазоне рН могут находиться только в протонированной форме. (Например, рКа групп гидрохинона 9,85 и 11,4 [19]).

Данные утверждения подтверждаются исследованиями по антигенному картированию пероксидазы хрена [20]. Выявленные эпитопы содержали несколько функционально важных остатков: His-42 и Arg-38, входящих в активный центр пероксидазы, вблизи которых находятся гидрофобные аминокислотные остатки (Phe-142 и 143), формирующие канал доступа ароматических субстратов к активному центру фермента.

Из рН-зависимостей lgKi, в реакциях окисления о-дианизидина, определяются две ионогенные группы с рКа 4,69 и 6,49 (рис. 5, кривая 1), а гидрохинона - одна ионогенная группа с рКа 6,8 (рис. 5, кривая 2).

Проявление этих групп, по-видимому, вызвано наличием в составе молекулы индолил-3-уксусной кислоты карбоксильной группы с рКа 4,54 [19], протонирование и депротонирование которой позволяет выявить две ионогенные функциональные группы активного центра пероксидазы, принимающие участие в пероксидазном окислении о-дианизидина и одну - в окислении гидрохинона.

Известно, что в области активного центра пероксидазы располагаются несколько ионогенных групп, принимающих участие в катализе. Так, например, в пероксидазном окислении n-крезола, ферроцианида и йодида выявлены ионогенные группы фермента с рКа 5,7 и 8,6, которые участвуют в каталитическом процессе [21]. В комплексообразовании пероксидазы с Nэтиламид о-сульфобензоилуксусной кислоты принимают участие две ионогенные группы с рКа 3,5 и 5,5, протонирование и депротонирование которых влияло на спектральные характеристики фермент-субстратного комплекса [22]. В работе [11] высказывается предположение, что некоторое Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 930 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/081.pdf lgKi -3,-4,-5,p H Рис. 5. рН-Зависимости константы ингибирования реакций пероксидазного окисления о-дианизидина (1) и гидрохинона (2) индолил-3-уксусной кислотой. Кривые являются теоретическими для рКа(ОДН+ИУК)=4,69, Kа(lim)=23,8 мкМ; рКв(ОДН+ИУК)=6,49, Kв(lim)=22,6 мкМ; рКв(ГХ+ИУК)=6,80, Кв(lim)=104 мкМ.

Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 931 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/081.pdf расхождение в величинах рКа-групп активного центра пероксидазы, повидимому, можно объяснить за счет того, что окисленное состояние железа гема оказывает сильное влияние на диссоциации близлежащих групп.

Поэтому группы с рКа 3,5 и 5,7, а также с рКа 5,5 и 8,6, выявляемые у нативной и окисленной формах пероксидазы, можно отнести к одним и тем же двум разным группам активного центра фермента. Одной из них может быть карбоксильная группа [22], а другой имидазол гистидина [23]. Эти же группы проявляют себя в реакциях ингибирования пероксидазы ИУК в реакциях окисления о-дианизидина и гидрохинона.

Выявленные закономерности имеют важное биологическое значение, поскольку раскрывают роль пероксидазы в процессах прорастания семян. На основании полученных данных можно предположить, что ИУК связываясь в составе дистального домена активного центра фермента, способна ингибировать протекание пероксидазных реакций переключая их на оксидазные. При этом пероксидаза будет выполнять роль высокоспецифичной оксигеназы ауксина. Это, возможно, является условием проявления функциональной роли фермента в прорастающих семенах растений.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Якушкин Н.И. Физиология растений. М.:Просвещение, 1993. С.275-279.

2. Полевой В.В. Физиология растений. М.:Высш.шк., 1989. С.39-42.

3. Grierson D., Covey S. Plant molecular biology. New York, 1984. 176 p.

4. Metodiewa D., Pieres de Melo M., Escobar J.A., Cilento G., Dunford H.B.

Horseradish peroxidase-catalysed aerobic oxidation and peroxidation of indole-3acetic acid.I.Optical spectra// Arch. Biochem. and Biophys.-1992.-V.296.-N 1.P.27-33.

5. Park R.D., Park C.K. Oxidation of indole-3-acetic acid - amino acid conjugates by horseradish peroxidase//Plant Physiol.-1987.- V.84.-N 3.-P.826-829.

Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 932 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/081.pdf 6. Pieres de Melo M., Escobar J.A., Metodiewa D., Dunford H.B., Cilento G.

Horseradish peroxidase - catalyzed aerobic oxidation of indole-3-acetic acid.

II.Oxygen uptake and chemiexcitation//Arch. Biochem. and Biophys.-1992.V.296.-N 1.-P.34-39.

7. Савицкий П.А., Рожкова А.М., Тишков В.И., Упоров И.В., Руденская Г.Н., Газарян И.Г. Существование центра связывания индолил-3-уксусной кислоты в пероксидазах растений. Структурное сходство пероксидаз и ауксинсвязывающих белков//Биохимия.- 1998.-Т.63.-N 6.-C.749-754.

8. Ogawa S., Shira Y., Morishima I. Calcium binding by horseradish peroxidase C and the heme enviromental structure.//Biochem. Biophys. Res. Commun.-1979.V.90.-N2.-P.674-678.

9. Falk J.E. Porphyrins and Metalloporphyrins. Amsterdam.-N.Y.-London etc.:

Elsevier, 1964. 236 p.

10. George P. The chemical nature of the second hydrogen peroxide compound formed by cytochrome C peroxidase and horseradish peroxidase:-.Titration with reducing agents.//Biocem.J.-1953.-V.54.-N2.-P.267-276.

11. Лебедева О.В., Угарова Н.Н., Березин И.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена.//Биохимия.-1977.-Т.42.-N8.-C.1372-1379.

12. Chance B. The properties of the enzyme substrate compounds of horseradish and lactoperoxidase//Science.-1949.-V.109.-N 103.-P.204-208.

13. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Механизм совместного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона в присутствии пероксидазы хрена//Биорган. химия.-1999.-Т.25.-N 5.-С.377-382.

14. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики.-М:МГУ, 1976. 320 с.

15. Лебедева О.В., Угарова Н.Н. Механизм пероксидазного окисления.

Субстрат-субстратная активация в реакциях, катализируемых пероксидазой хрена//Известия РАН. Сер. химическая.-1996.-N 1.-C.25-32.

Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 933 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/081.pdf 16. Угарова Н.Н., Лебедева О.В., Савицкий А.П. Пероксидазный катализ и его применение.-М.:МГУ, 1981, 92 с.

17. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии.М.:Мир, 1981. Т.1. С.261-266.

18. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Стационарная кинетика совместного пероксидазного окисления гидрохинона и о-дианизидина в присутствии пероксидазы хрена//Биохимия.-1999.-Т. 64.-N 2.-С. 219-224.

19. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика, М:Мир, 1991. 544 с.

20. Аммосова Т.Н., Упоров И.В., Рубцова М.Ю., Игнатенко О.В., Егоров А.М., Колесанова Е.Ф., Арчаков А.И. Антигенное картирование пероксидазы хрена (изофермент С)//Биохимия.-1997.-Т.62.-N 4.-C.516-524.

21. Critchlow J.E., Dunford H.B. The kineties and stoichiometry of the transition from the primary to the secondary peroxidase peroxide complexes//J. Biol.

Chem.-1972.-V. 247.-P.3714-3715.

22. Рогожин В.В. Роль карбоксильных и гуанидиновых групп в функционировании пероксидазы хрена. Дисс. канд. хим. наук, М:МГУ, 1984.

22 с.

23. Jamada H., Jamasaki J. Effect of modification of function groups on the reactivity of horseradish peroxidase //Arch. Biochem. and Biophys.-1974.-V.165.P.728-738.

Pages:     | 1 ||



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.