WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 |
Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 918 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/081.pdf Влияние индолил-3-уксусной кислоты на кисление о-дианизидина и гидрохинона в присутствии пероксидазы В.В. Рогожин (vrogozhin@mail.ru ), Т.В. Рогожина Якутская государственная сельскохозяйственная академия, Индолил-3-уксусная кислота (ИУК) входит в группу природных фитогормонов - ауксинов. Наиболее богаты содержанием ИУК растущие части растительного организма: верхушки стебля, молодые части листьев, почки, завязи, прорастающие семена. Образование ИУК в большинстве случаев идет в меристематических тканях. Основным источником для образования ИУК является аминокислота триптофан. В растениях разрушение ИУК происходит с участием специализированной ИУКоксидазы. Наряду с ферментативным окислением ИУК может разрушаться под действием ультрафиолетовых лучей с длиной волны около 280 нм [1].

ИУК активирует деление и растяжение клеток, необходима для формирования проводящих пучков и корней, способствует растяжению околоплодника. Проникая в клетки, ИУК связывается со специфическими рецепторами, оказывая влияние на функциональную активность мембран, полирибосом и ядерного аппарата. Установлено, что в плазмалемме ауксин индуцирует работу Н+-помпы, в результате чего матрикс клеточных стенок закисляется. Это приводит к усилению активности кислых гидролаз и размягчению клеточных стенок, что является необходимым условием для роста клеток растяжением [2]. В конце роста растяжением усиливается лигнификация клеточных стенок, накапливаются ингибиторы фенольной природы и абсцизовая кислота, возрастает активность пероксидазы и оксидазы ИУК, снижающие общее содержание ауксина в тканях [3]. Участие пероксидазы в этих процессах обусловлено тем, что ИУК является субстратом фермента. Известно, что окисление ИУК пероксидазой протекает через образование тройного комплекса фермент-ИУК-кислород.

Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 919 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/081.pdf Исследования механизма окисления ИУК пероксидазой растений показали, что на поверхности белковой глобулы должен располагаться участок связывания ауксина [4-6], который может находиться в составе дистального домена фермента [7]. При этом считается, что активную роль в катализе пероксидазы принимает участие остаток Trp-117, удаленный на 8-9 от атомов азота порфиринового цикла, т.е. находящегося в зоне туннелирования электронов. При этом субдомен, включающий структурно сходные участки в дистальном домене пероксидазы, формируется в направлении от активного центра к поверхности дистального домена, противоположной входу в активный центр. Таким образом предполагается, что центр связывания ИУК может располагаться вдали от активного центра пероксидазы [7]. Причем оксидазное окисление ИУК может возрастать в присутствии гидрофобных аминокислот, тогда как полярные аминокислоты почти не оказывают влияние на каталитический процесс оксидазного окисления ауксина.

Установлена прямая корреляция между гидрофобностью аминокислот и степенью их влияния на скорость окисления ИУК [5]. Однако в литературе отсутствуют данные по влиянию ИУК на пероксидазное окисление различных неорганических и органических субстратов, катализируемое пероксидазой растений. Возможно, что проведение таких исследований позволило бы определить расположение активного центра фермента на поверхности белковой глобулы, установить участки индивидуального связывания ИУК и исследуемых субстратов на ферменте.

Поэтому целью данной работы было изучить влияние индолил-3уксусной кислоты на пероксидазное окисление о-дианизидина (ОДН), гидрохинона (ГХ) и ферроцианида калия (ФК) в широком диапазоне рН;

предложить механизм пероксидазного окисления выбранных субстратов в присутствии ИУК.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 920 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/081.pdf Реактивы. В работе использовали пероксидазу хрена производства "Reanal" (Венгрия) со спектральным показателем чистоты RZ=1,0. Концентрацию фермента определяли спектрофотометрически при 403 нм (=100 мМ-1см-[8]) и по пиридингемохромогену [9]. Использовали гидрохинон и индолил-3уксусную кислоту фирмы "Serva" (Германия), а ферроцианид калия - "Реахим" (Россия); о-дианизидин марки ч. очищали возгонкой в вакууме.

Концентрацию перекиси водорода ("Реахим", Россия) определяли спектрофотометрически, используя молярный коэффициент поглощения при 230 нм 72,7 М-1см-1 [10].

Методы. Реакцию окисления о-дианизидина (17,2-172 мкМ), гидрохинона (0,1-0,5 мМ) или ферроцианида калия (0,36-1,44 мМ) перекисью водорода (0,64 мМ) проводили при 23о в среде 0,1 М натрий-ацетатного, рН 4,5-6,0, или 0,1 М натрий-фосфатного, рН 6,0-7,5, буферов объемом 2,5 мл при различных концентрациях пероксидазы хрена. Окисление о-дианизидина регистрировали по возрастанию поглощения при 460 нм (=30 мМ-1см-1 [11]), ферроцианида калия - при 420 нм (=1050 М-1см-1 [12]). За окислением гидрохинона наблюдали по уменьшению поглощения при 290 нм (=2,2 мМ-1см-1 [13]).

Ингибирование пероксидазного окисления о-дианизидина и гидрохинона индолил-3-уксусной кислотой изучали путем добавления в кювету вместе с субстратами (при насыщающей концентрации одного из субстратов) пероксидазы ингибитора. Кинетические кривые снимали на двухлучевом спектрофотометре DMS 100 S фирмы “Varian” (США). За единицу активности фермента принимали его количество, окисляющее мкмоль субстрата (о-дианизидина, гидрохинона и ферроцианида калия) за мин. Кажущиеся константы скорости окисления субстратов пероксидазы определяли из данных по стационарной кинетике [14].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 921 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/081.pdf Изучено влияние индолил-3-уксусной кислоты на пероксидазное окисление о-дианизидина, гидрохинона и ферроцианида калия, катализируемое пероксидазой хрена. Показано, что при рН 4,5-7,зависимости начальных скоростей пероксидазного окисления о-дианизидина в присутствии ИУК в координатах Лайнуивера-Берка имели вид пучка прямых, пересекающихся на оси ординат, что соответствует конкурентному типу ингибирования (рис. 1).

Графики зависимостей обратных начальных скоростей пероксидазного окисления гидрохинона в присутствии ИУК при рН 4,5-6,имели вид семейства прямых, пересекающихся на оси абсцисс, что указывает на неконкурентный характер ингибирования (рис. 2). При рН 7,0-7,5 характер зависимостей изменялся и соответствовал смешанному типу ингибирования, при котором кривые пересекаются в общей точке в левом верхнем квадранте (рис. 3).

Индолил-3-уксусная кислота в концентрациях 10-300 мкМ не влияла на пероксидазное окисление ферроцианида калия при рН 4,5-7,0.

Известно, что пероксидаза катализирует окисление неорганических и органических соединений, различающихся между собой по строению.

Широкая субстратная специфичность фермента, позволяет предположить о наличии различных механизмов пероксидазного окисления, реализуемых ферментом [15]. К числу неорганических субстратов пероксидазы относятся ферроцианид-, сульфит-, нитрит-, тиоцианат- и др. ионы, тогда как в группу органических соединений входят НАДН, аскорбиновая кислота, одианизидин, гидрохинон, фенотиазины и др. [16]. В реакциях индивидуального окисления субстраты пероксидазы могут подразделяться Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 922 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/081.pdf 1/V, мин мкМ-1 1,0,0,-40 -20 0 20 40 1/ОДН, мМ-Рис. 1. Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления одианизидина от его концентрации, в двойных обратных координатах, при различных концентрациях индолил-3-уксусной кислоты, мкМ: 1-0, 2-10, 3-20, 4-30; пероксидаза - 0,56 нМ; перекись водорода - 0,64 мМ; 0,1 М натрийфосфатный буфер, рН 7.

Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 923 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/081.pdf 1/V, мин мкМ--202468 1/ГХ, мМ-Рис. 2. Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления гидрохинона от его концентрации, в координатах Лайнуивера-Берка, при различных концентрациях индолил-3-уксусной кислоты, мкМ: 1-0, 2-20, 3-40, 4-60; пероксидаза - 4,0 нМ; перекись водорода - 0,64 мМ; 0,1 М натрийацетатный буфер, рН 5.

Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 924 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/081.pdf 1/V, мин мМ--4 -2 0 2 4 6 8 1/ГХ, мМ-Рис. 3. Зависимости начальной скорости пероксидазного окисления гидрохинона от его концентрации, в двойных обратных координатах, при различных концентрациях индолил-3-уксусной кислоты, мкМ: 1-0, 2-20, 3-40, 4-80; пероксидаза - 4,0 нМ; перекись водорода - 0,64 мМ; 0,1 М натрийфосфатный буфер, рН 7,5.

Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 925 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/081.pdf на медленно и быстро окисляемые. При этом величины констант Михаэлиса у них различаются незначительно, при наибольшей разнице в величинах каталитических констант. В группу медленно окисляемых субстратов входят как неорганические, так и органические соединения - доноры электронов.

Тогда как доноры водорода являются быстро окисляемыми субстратами пероксидазы. При рассмотрении механизма действия пероксидазы в реакциях окисления различных субстратов применяется модель, в которой действие пероксидазы объясняется в рамках представления о ферменте как белкепроводнике, реализующим несколько каналов транспорта электронов с субстратов, контактирующих с поверхностью белковой глобулы на железо гема [15]. Однако вопрос об участке связывания субстратов в активном центре пероксидазы пока остается не выясненным. Хотя с помощью компьютерных методов показано, что аминокислотные последовательности пероксидаз растений и ауксин-связывающих белков содержат близкие по структуре участки. При этом определенные пять из шести структурно сходных участков находятся в составе дистального домена пероксидаз и формируют субдомен, включающий последовательность, координирующую гем с дистальной стороны активного центра [7]. Поэтому проведенные исследования по влиянию ИУК на пероксидазное окисление субстратов пероксидазы позволяют высказать некоторые предположения о местах связывания субстратов на поверхности фермента.

Конкурентный тип ингибирования реакции пероксидазного окисления о-дианизидина ИУК позволяет предположить, что ОДН и индолил-3уксусная кислота связывается в одном и том же месте активного центра фермента. При этом связывание ИУК препятствует как связыванию, так и превращению о-дианизидина. Тогда как по отношению к гидрохинону тип ингибирования несколько другой. ИУК и гидрохинон связываются в различных местах активного центра, однако, если индолил-3-уксусная кислота связывается на поверхности фермента, то дальнейшее превращение гидрохинона становиться невозможным. Это может наблюдаться вследствие Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 926 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/081.pdf удаленности мест связывания эффектора и субстрата или в результате конформационных изменений глобулы фермента при связывании ингибитора [17]. Причем при рН 4,5-6,5 тип ингибирования неконкурентный, однако при увеличении рН он меняется и становиться смешанным. При этом увеличивается (>1), а уменьшается (<1). Изменение этих постоянных характеризует ухудшение связывания субстрата в 2,8-4,2 раза, т.е. при наличии ИУК происходит понижение сродства гидрохинона к активному центру фермента. Однако, если все таки гидрохинон связался в активном центре, то дальнейшее его превращение ухудшается в 1,7-5,3 раза.

Связывание ИУК с пероксидазой зависит от рН среды. Так в реакциях пероксидазного окисления о-дианизидина величина Ki при рН 4,5-7,изменяется в диапазоне от 9,6 до 0,72 мкМ, т.е. с возрастанием рН сродство ингибитора к ферменту может повышаться в 13,3 раза. Тогда как в реакциях окисления гидрохинона величина Ki, в этом же диапазоне рН изменяется от 113 до 17 мкМ, т.е. константа ингибирования понижается в 6,6 раза. При этом эффективность связывания ИУК с пероксидазой, например, при рН 4,и 7,0 лучше связывания о-дианизидина в 4,2 и 20,8 раз, а гидрохинона - 5,8 и 8,8 раз соответственно. В реакциях пероксидазного окисления о-дианизидина связывание ИУК с ферментом при рН 4,5 и 7,0 было в 11,8 и 23,6 раза соответственно эффективнее, чем в реакциях окисления гидрохинона. Повидимому, на сродство ингибитора к ферменту оказывает влияние природа субстрата. Причем субстраты, имеющие близкую с ИУК полярность, значительно повышают эффективность связывание ингибитора с пероксидазой. Аналогичные зависимости были получены при изучении связывания ИУК в присутствии гидрофобных и полярных аминокислот [5].

Показано, что увеличение гидрофобности аминокислоты повышает сродство ауксина к ферменту. Поэтому, преимущественным местом связывания ИУК и о-дианизидина в активном центре пероксидазы, по-видимому, должна быть гидрофобная область. Тогда как для гидрохинона местом связывания Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 927 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2003/081.pdf является область на поверхности фермента, содержащая большее число полярных или заряженных аминокислотных остатков. Подтверждением различных мест связывание о-дианизидина и гидрохинона в активном центре пероксидазы служат данные по совместному пероксидазному окислению этих субстратов. Пероксидазное окисление о-дианизидина и гидрохинона происходит дифференцированно. При этом окисление о-дианизидина не наблюдается до полного превращения гидрохинона. Причем скорость окисления гидрохинона в присутствии о-дианизидина превышает скорость его индивидуального окисления в 3-10 раз. Механизм совместного окисления субстратов проявляется в том, что предварительное связывание одианизидина улучшает последующее связывание гидрохинона, ускоряя процесс его пероксидазного окисления [18]. Несколько иной механизм отмечается при совместном окислении ферроцианида калия и гидрохинона.

Окисление ферроцианида не происходило до тех пор, пока полностью не окислялся весь гидрохинон. Это происходит из-за того, что гидрохинон и ферроцианид связываются в одном и том же месте. Поэтому предварительное связывание гидрохинона препятствует последующему связыванию, а следовательно, и окислению ферроцианида. Однако индолил-3-уксусная кислота не оказывала влияние на пероксидазное окисление ферроцианида калия, что, возможно, обусловлено удаленностью участка связывания субстрата от области связывания ИУК.

Pages:     || 2 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.