WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 |
29 БIОФIЗИЧНИЙ ВIСНИК Вип. 22 (1). 2009 МОЛЕКУЛЯРНА БІОФІЗИКА УДК 557.12.577.112:24.

ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ ФИБРИЛЛ, ОБРАЗОВАННЫХ IN VITRO ИЗ КОЛЛАГЕНА, СИНТЕЗИРОВАННОГО В КОЖЕ ПОД ДЕЙСТВИЕМ МЕХАНИЧЕСКОГО НАПРЯЖЕНИЯ Т.В. Жукова, Ю.Г. Кот, Н.И. Буланкина, Е.Э. Перский, Е.В. Фальченко Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, кафедра биохимии.

пл. Свободы, 4, 61077, Харьков, Украина, тел.: +38-057-707-5502, Е-mail: epersky@list.ru Поступила в редакцию 29 апреля 2009 г.

Принята 11 мая 2009 г.

In vitro изучено влияние механического напряжения в коже крыс на окислительное дезаминирование -NH2-групп лизила и гидроксилизила и функциональные свойства синтезирующегося в ней коллагена типа І. Показано, что в коллагене, который синтезируется под влиянием напряжения, содержание свободных -NH2-групп выше, а уровень поперечного межмолекулярного связывания ниже, чем в коллагене, синтезирующемся в отсутствии напряжения в коже. В результате этого образующиеся путём самосборки фибриллы первого имеют меньшие длину и термостабильность, чем фибриллы второго.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: соединительная ткань, механическое напряжение, коллаген, окислительное дезаминирование, поперечные сшивки, термостабильность.

В последние годы было обнаружено, что деформация клеток соединительной ткани, происходящая под действием механического напряжения, приводит к интенсификации синтеза в ней структурных биополимеров, в том числе и коллагена [1 - 4]. При этом происходит рассогласование между интенсивностью сборки его полипептидных цепей на рибосомах и уровнем их посттрансляционной модификации, которая осуществляется рядом ферментов процессинга [5,6]. Этот эффект должен приводить к изменению конечной структуры, а значит, и свойств его молекул. В предыдущей работе было показано, что степень гидроксилирования пролила и, соответственно, термостабильность молекул коллагена типа І, синтезированного в коже при её растяжении, ниже, чем у коллагена, синтезированного в отсутствии растяжения [7].

Важнейшим этапом посттрансляционной модификации коллагена является происходящее под действием лизилоксидазы окислительное дезаминирование -NH2групп лизила и гидроксилизила с превращением последних в аллизил и гидроксиаллизил, которые содержат, вместо -NH2-, альдегидные СОН-группы. Эта модификация необходима для образования в надмолекулярных коллагеновых структурах поперечных ковалентных связей. Они образуются при взаимодействии либо двух СОН- групп (альдоли), либо -NH2-групп с СОН-группами (шиффовы основания) соседних молекул [8, 9]. В настоящем сообщении рассматривается связь между степенью окислительного дезаминирования -NH2-групп лизила и гидроксилизила в коллагене типа І, который синтезируется в коже при растяжении, морфологией и термостабильностью образующихся из него надмолекулярных структур in vitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Эксперименты проведены на коже 3-месячных крыс - cамцов линии Вистар.

Образцы кожи (20 5) мм с длинной стороной вдоль спины очищали от подкожножирового слоя и волосяного покрова и инкубировали в растворе Рингера-Кребса Т.В. Жукова, Ю.Г. Кот, Н.И. Буланкина, Е.Э. Перский, Е.В. Фальченко на протяжении 6 часов при 360 С, растягивая их в продольном направлении при статических напряжениях = 0; 0,075; 0,1; 0,12; 0,18; 0,24 МН/м2.

Проинкубированные образцы растирали в жидком азоте до порошкообразного состояния. Коллаген I типа экстрагировали из порошка 1М NaCl и извлекали из экстракта диализом [2]. Концентрацию коллагена рассчитывали по гидроксипролину [ 10 ].

Степень окислительного дезаминирования лизила и гидроксилизила оценивали по содержанию свободных -амино- и альдегидных групп, которые измеряли методами [11] и [12], соответственно. Уровень ковалентного поперечного связывания коллагена в образцах кожи оценивали по его растворимости в 1 М NaCl и выражали в процентах от общего содержания коллагена в ткани.

Фибриллы получали путём их самосборки [ 12, 13 ] в растворах коллагена типа І c концентрацией 0,2 – 0,3 %, инкубировали 10 суток при 200 С и измеряли температуру и энтальпию их денатурации на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре DASM-4 при концентрации белка в кюветах 10 – 13 мкг. Скорость нагрева образцов составляла 1 град/мин.

Образование фибрилл контролировали микрофотографически цифровой камерой Canon A410 на поляризационном микроскопе МП-2 при 510 - кратном увеличении.

При статистической обработке результатов использовали критерии достоверности Стьюдента и Манна-Уитни. Достоверными считали результаты с р<0,05.

Данные, представленные на графиках, типичные для серии повторных измерений (не менее трёх в каждой серии). Контуры соответствующих распределений фибрилл коллагена по их длинам и диаметрам разлагали на пики максимумов значений, форма которых описывалась линейной комбинацией функций Гаусса FG и Лоренца FL при помощи пакета программ Origin Pro 7.5. [17].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Как видно из табл. 1, с ростом растягивающего напряжения в коже число свободных -NH2 групп лизила и гидроксилизила в коллагене увеличивается, а число свободных альдегидных СОН-групп, образующихся из -NH2 – групп в аллизиле и гидроксиаллизиле, уменьшается.

Таблица Влияние растягивающего механического напряжения в коже на содержание свободных -NH2 – групп лизила и гидроксилизила и альдегидных СОН-групп аллизила и гидроксиаллизила в коллагене типа І, мг/г коллагена Свободные, МН/мгруппы 0 0,075 0,12 0,-NH2 - 5,0±1,8 32,0±2,0* 34,0±1,5* 28,0±3,2*,** СОН - 52,0±3,1 28,1±4,4* 26,0±2,9* 34,1±1,7*,** Примечания: * - достоверно (р<0,05) относительно контроля ( = 0); **- достоверно (р<0,05) относительно предыдущего значения механического напряжения.

Обнаруженный эффект является результатом снижения активности лизилоксидазы.

Механизм этого явления может заключаться, например, в постоянстве концентрации этого фермента при резком увеличении концентрации молекул коллагена в результате интенсификации его синтеза, что и приводит к снижению степени модификации.

Свободные альдегидные группы – это промежуточный продукт образования Термостабильность фибрилл, образованных in vitro из коллагена … поперечных ковалентных связей [8]. Обнаруженное уменьшение количества этих групп в коллагене, действительно, приводит к уменьшению степени поперечного ковалентного связывания, что подтверждается снижением его растворимости в коже при действии на неё растягивающего механического напряжения (табл. 2).

Таблица 2.

Влияние растягивающего механического напряжения в коже на растворимость коллагена типа І, %.

, МН/м2 0 0,1 0,18 0,Растворимость, % 1,50 ± 0,18 2,30 ± 0,10* 2,60 ± 0,20* 2,50 ± 0,10* Примечание: * - достоверно (р<0,05) относительно контроля ( = 0) Кривые зависимости теплопоглощения от температуры для фибрилл, которые были образованы из коллагена типа І, синтезированного в коже в отсутствие растягивающего напряжения и при напряжении 0,18 МН/м2 и инкубированных в течение 10 суток при температуре 180С, представлены на рис.1.

Рис. 1. Теплопоглощение фибрилл, образованных из коллагена типа I, синтезированного в коже в отсутствии растягивающего механического напряжения (А, 10,8 мкг коллагена в кювете ) и при напряжении 0,18 МН/м2 (Б, 12,4 мкг коллагена в кювете) после 10 суток инкубации.

Как видно, в обоих случаях эти зависимости характеризуются двумя пиками, причём высоты и площади пиков на каждой из кривых различны. Это свидетельствует, во-первых, о гетерогенности всех исследуемых образцов, которые состоят, по меньшей мере, из двух фракций. Во-вторых, о том, что удельные доли этих фракций в образцах фибрилл, образованных из коллагена, синтезированного в коже в отсутствии и при наличии растягивающего напряжения, различны. И, в-третьих, о том, что энергия, необходимая для разрушения фибрилл, относящихся к пикам І и ІІ, различна.

Соответствующие значения энтропии и энтальпии плавления фибрилл приведены в Табл. 3.

Полученные результаты можно объяснить следующим образом. Молекула коллагена типа І представляет собой жёсткую палочкообразную тройную спираль из полипептидных цепей с диаметром и длиной около 0,15 и 300 нм соответственно. В Т.В. Жукова, Ю.Г. Кот, Н.И. Буланкина, Е.Э. Перский, Е.В. Фальченко соответствии со специфической первичной структурой полипептидных цепей, вдоль поверхности молекулы чередуются области, состоящие из гидрофобных и полярных аминокислотных остатков. Такое распределение радикалов аминокислотных остатков вдоль поверхности молекулы лежит в основе ярко выраженной способности коллагена типа І к самосборке в надмолекулярные структуры – фибриллы [13, 14].

Таблица 3.

Температура (ТD), энтальпия (Н) и энтропия (S) денатурации фибрилл, образованных из коллагена типа I, синтезированного в коже в отсутствии растягивающего механического напряжения и при напряжении 0,18 МН/м2 после 10 суток инкубации.

= 0 = 0,18 МН/м Показатель Пик І Пик ІІ Пик І Пик II ТD, 0С 38,6±0,4 46,0±0,3 38,0±0,2 45,3±0,Н, Дж/г 78,8± 2,6 133,0±5,9 78,8±1,6 90,9±3,1* S, Дж/г град 0,25± 0,03 0,42±0,03 0,25±0,04 0,28±0,06* Примечание. * - достоверно (р < 0,05) относительно контроля ( = 0) В латеральном направлении агрегация происходит за счёт взаимодействия гидрофобных и полярных областей, причём соседние молекулы, расположенные параллельно, сдвинуты относительно друг друга на четверть их длины.

В продольном направлении фибриллы растут за счёт образования межмолекулярных связей между -NH2-группами лизила и гидроксилизила и СОН- группами аллизила и гидроксиаллизила в N- и С- концевых участках молекул коллагена, расположенных последовательно и лежащих в соседних рядах.

Схема строения фибрилл и влияние на неё степени поперечного межмолекулярного связывания представлены на Рис. 2.

Рис. 2. Схема строения фибрилл коллагена типа I в зависимости от степени поперечного межмолекулярного сшивания. А – короткая фибрилла, в которой молекулы в соседних рядах связаны только электростатическими и гидрофобными взаимодействиями. Б – фибрилла средних размеров, с малым количеством межмолекулярных сшивок. В – длинная фибрилла, в которой молекулы в соседних рядах связаны, кроме электростатических и гидрофобных взаимодействий, межмолекулярными сшивками. Внутримолекулярные сшивки не влияют на длину фибрилл.

В большом числе калориметрических исследований было показано, что кривые денатурации свежевыделенных из тканей молекул коллагена в растворе имеют один пик теплопоглощения [15,16]. Свежевыделенный из кожи коллаген типа І, Термостабильность фибрилл, образованных in vitro из коллагена … синтезированный в ней в отсутствии и при наличии растягивающего напряжения, также характеризуется одним пиком теплопоглощения [7].

Поэтому обнаруженный двухступенчатый характер денатурации фибрилл свидетельствует о следующем. Показано [15], что образование фибрилл в растворе в области температуры и рН, близких физиологическим, не сопровождается тепловым эффектом. При этом теплота плавления фибрилл, образованных в этих условиях, составляет около 80 Дж/г белка. Эта величина совпадает с теплотой денатурации индивидуальных молекул коллагена типа І из кожи крысы и близка значениям для пика 1 коллагена, синтезированного как в отсутствии, так и при наличии напряжения в коже (Табл. 3).

Такое совпадение свидетельствует о том, что первые этапы образования фибрилл определяются, в основном, слабыми гидрофобными и электростатическими взаимодействиями комплементарных участков, расположенных в полярных и неполярных областях молекул коллагена. Эти взаимодействия, по-видимому, не вносят существенного вклада в общую структурную энергию образованных агрегатов.

Таким образом, пик 1 соответствует, по-видимому, теплопоглощению смеси агрегатов, не содержащих или содержащих малое количество межмолекулярных сшивок.

Возникновение сильных высокоэнергетичных ковалентных связей между молекулами коллагена в фибриллах в результате альдольной конденсации и образования шиффовых оснований происходят лишь через некоторое время после образования первичных агрегатов. В соответствии с полученными данными, за 10 суток в части фибрилл образовалось достаточное количество таких связей, чтобы энергия их разрушения значительно превысила энергию денатурации фибрилл, связанных только электростатическими и гидрофобными взаимодействиями.

Таким образом, пик 2 представляет собой теплопоглощение фибрилл, содержащих большое количество межмолекулярных сшивок.

Однако значительно меньшая величина энтальпии денатурации фибрилл, относящихся к этому пику и образованных из коллагена, который синтезировался при напряжении в коже (Табл.3, пик 2), свидетельствует о том, что они содержат меньшее число межмолекулярных сшивок по сравнению с коллагеном, синтезированными в отсутствие напряжения.

Это является прямым следствием снижения уровня окислительного дезаминирования -NH2-групп лизила и гидроксилизила в коллагене типа І, который синтезируется в коже при растяжении ( Табл. 1).

Различное количество межмолекулярных сшивок в фибриллах должно привести и к различиям в их строении. На Рис. 3 приведены микрофотографии фибрилл, образованных из коллагена типа І, синтезированного в коже в отсутствие растягивающего напряжения и при напряжении 0,18 МН/м2, и инкубированных в течение 10 суток при температуре 20 0С, а на Рис. 4 и 5 представлены распределения обоих типов фибрилл по длинам и диаметрам.

Т.В. Жукова, Ю.Г. Кот, Н.И. Буланкина, Е.Э. Перский, Е.В. Фальченко Рис. 3. Микрофотографии фибрилл, образованных из коллагена типа I, синтезированного в коже в отсутствии растягивающего механического напряжения (А) и при напряжении 0,18 МН/м(Б) после 10 суток инкубации.

Как видно, морфология фибрилл, образованных из коллагена, синтезированного в отсутствие и при наличии напряжения в коже, различна.

Длины первых лежат в широком диапазоне от 200 до 3200 нм с максимумом 600 – 700 нм, соответствующим удвоенной длине молекулы коллагена типа І.

Длины вторых не превышают 1700 нм, при этом максимальное количество фибрилл имеет длину 300 – 400 нм, т.е. длину одной молекулы.

Характерно, что максимальное количество этих фибрилл на 13% превышает максимальное количество фибрилл первого типа.

Рис. 4. Распределение по длинам фибрилл, образованных из коллагена типа I, синтезированного в коже в отсутствии растягивающего механического напряжения (А) и при напряжении 0,18 МН/м2 (Б), после 10 суток инкубации.

Pages:     || 2 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.