WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 || 10 | 11 |   ...   | 85 |

В контроле (нейтрофилы без воздействия) показатели среднего цитохимического коэффициента (СЦК) составили 1,37±0,7, после инкубации с квантовыми точками наблюдается изменение активности лизосомально-катионных белков: соответственно средний цитохимический коэффициент для CdSe/ZnS-МУК составил 0,89±0,68 (р<0,05), для (CdSe/CdZnS)ZnS-polyT – 0,88±0,68 (р<0,05) и для CdSeCdSZnS/polyT/SiO2-NH2 – 0,98±0,(р<0,05). Таким образом, после инкубации нейтрофилов со всеми типами квантовых точек наблюдается статистически значимое снижение СЦК по сравнению с контролем. Это свидетельствует о снижении кислород-независимых реакций у нейтрофильных гранулоцитов после воздействия на них наночастиц, а, следовательно, показывает один из вариантов реализации токсического эффекта квантовых точек.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 09-04-97068-р_поволжье_а.

Использование методов молекулярного моделирования для поиска новых ингибиторов тромбина Озеров Иван Витальевич (Москва, varnivey@mail.ru) В настоящее время методы компьютерного молекулярного моделирования становятся неотъемлемой частью фундаментальных исследований, направленных на изучение молекулярных механизмов функционирования белков, а также и прикладных проектов, связанных с рациональным дизайном новых лекарственных соединений. В частности метод молекулярного докинга (от англ. docking — стыковка), открывает заманчивые перспективы для исследователей, позволяя предсказывать пространственную структуру комплекса рецептор–лиганд и свободную энергию его образования, исходя из данных о пространственной структуре рецептора и химической структуре лиганда. Тем не менее современные алгоритмы докинга не всегда достаточно точны, чтобы с их помощью можно было сделать статистически достоверное предсказание для произвольной системы рецепторлиганд. Одним из способов улучшения предсказательной способности метода молекуляного докинга является создание системоспецифичных алгоритмов предсказания энергии связывания, основанных на статистических потенциалах. В основе таких потенциалов лежит параметризация на обучающих наборах данных о структуре комплексов.

В процессе работы была создана настраиваемая под конкретную систему функция оценки энергии связывания лигандов в активном сайте белка-мишени. В полученной оценивающей функции использованы современные подходы, такие как метод молекулярного гидрофобного потенциала для оценки гидрофобных взаимодействий и метод молекулярной динамики для оценки динамических свойств комплексов. В качестве тестового объекта был выбран тромбин, поскольку для него известно достаточное количество кристаллических структур с различными лигандами (44), используемых в процессе настройки алгоритма, а разработка специфических ингибиторов этого белка представляется весьма важной с практической точки зрения задачей. Тромбин играет важную роль в процессе свёртывания крови, поэтому поиск его ингибиторов поможет в создании новых антикоагулянтов.

Моделирование структурных свойств цитохрома с, способствующих снижению его электрон-транспортной активности Островерхова Т.В., Черткова Р.В. (Москва, tato-tato@list.ru) Цитохром c – белок из класса цитохромов, содержащих в своей структуре гем типа c.

Специализированная функция цитохрома с состоит в переносе электрона между белковыми комплексами III и IV митохондриальной дыхательной цепи.

Ранее предложена модель функционирования цитохрома c, предполагающая выведение атома железа из плоскости гема в процессе электронного транспорта. Была построена информационная структура цитохрома c при помощи метода анализа информационной структуры (АНИС-метода). В структуре цитохрома c были определены иерархически организованные элементы информационной структуры (ЭЛИС). В районе 73-88 а.о.

полипептидной цепи цитохрома c обнаружен сайт пониженной плотности ЭЛИС, или ADD-сайт. Названный участок содержит лиганд гема Met-80. Мы предположили, что подвижность атома железа в цитохроме c обеспечивается за счёт гибкости ADD-cайта.

С целью проверки данной гипотезы были сконструированы три мутантных варианта цитохрома c. Дизайн вариантов цитохрома c с различными аминокислотными заменами создавался на основе анализа коротких полипептидов, имеющих высокую степень гомологии с последовательностью цитохрома c дикого типа. Мутации сконструированных вариантов цитохрома c направлены на усиление структурированности его ADD-сайта и снижение электрон-транспортной функции цитохрома c. Гены с аминокислотными заменами были экспрессированы, а соответствующие мутантные белки выделены. В ходе измерений биологической активности полученных белков, выявили сниженные способности мутантного варианта T78S/K79P к взаимодействию с комплексом III и варианта I81Y/A83Y/G84N к взаимодействию с комплексом IV. В результате анализа полученных данных возникла идея избирательного взаимодействия аминокислотных кластеров цитохрома c, находящихся по разные стороны от Met-80, с белковыми комплексами дыхательной цепи.

Наряду с АНИС-методом для определения точечных аминокислотных замен, изменяющих структурные характеристики сайтов, окружающих Met-80, был использован молекулярнодинамический подход. Показано, что рассчитанные параметры с помощью метода молекулярной динамики имели слабую корреляцию с аналогичными параметрами, рассчитанными с помощью АНИС-метода. На последующих этапах моделирование структуры цитохрома c, направленное на повышение упорядоченности ADD-cайта, осуществляли при помощи АНИС-метода. Проанализирован ряд аминокислотных последовательностей в сайтах с различной плотностью ЭЛИС негомологичных белков и протеома E.coli. Определена частота встречаемости каждой аминокислоты в ЭЛИС разного ранга и выявлены наиболее вероятные аминокислоты, способствующие конструированию ADD+ сайта. Таким образом, обозначены основные направления по включению тех или иных аминокислот в сайт 73-88 а.о. с целью увеличения структурированности этого района.

В данный момент проводится анализ информационных структур цитохрома c с предложенными аминокислотными заменами. Результаты исследования АНИС-методом необходимы для определения конкретных мутаций в гене цитохрома c дикого типа.

Получение потенциал-зависимого калиевого канала Heagдля исследования методом электронной микроскопии Пищальникова Анастасия Владимировна (Москва, bionastya@gmail.com) Потенциал зависимые калиевые каналы, играют ключевую роль в фунционировании возбудимых клеток. Эти каналы также важны в качестве мишени для лекарственных агентов при различных заболеваниях и наследственных расстройствах. Для определения потенциальных сайтов связывания лигандов важно знание структуры канала. Для канала heag2, в настоящее время не известна ни его полная структура, и нет никаких прямых структурных данных о строении и расположении его цитоплазматических доменов, которые играют важную роль в функционировании канала.

В данной работе канал heag2 был экспрессирован в эукариотической клеточной линии Vero, выделен и очищен на аффинной колонке с пришитыми к ней поликлональными антителами к 1D4-последовательности, расположенной на С-конце канала. Высокий уровень трансфекции был получен при использовании коммерческого трансфекционного агента MetafectenTM PRO (Biontex). Успешность экспрессии и очистки канала была подтверждена методом белкового электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) и вестерн-блотом.

То, что экспрессированные каналы heag2 имеют правильную структуру было подтверждено с помощью флуоресцентно-меченного аджитоксина AgTx2. Данный токсин обратимо связывается с поровой частью канала, расположенного в мембране клетки.

Связывание происходит только с теми молекулами калиевых потенциал-зависимых каналов, которые образуют правильный гомотетрамер. Окраска происходит только с внешней стороны клеток и только тех каналов, которые находятся в клеточной мембране. Таким образом данный метод позволил подтвердить успешность трансфекции каналов и правильность их структуры непосредственно на живой клеточной культуре.

Было получено достаточное количество белка канала heag2 для исследования его структуры методом электронной микроскопии с негативным окрашиванием. В результате исследования были получены электронные микрофотографии с отчетливым изображением отдельных молекул канала.

В дальнейшем, посредством обработки полученных двумерных изображений канала heag2, предполагается получить трехмерную структуру данного канала, а также определить локализацию цитоплазматичекого домена PAS. Для этого планируется получить структуру мутантного канала heag2PAS, у которого отсутствует цитоплазматический домен PAS, и сравнить её со структурой полноразмерного канала для определения локализации домена PAS. Полученные структурные данные могут способствовать лучшему понимания механизмов функционирования калиевых потенциал-зависимых каналов.

Молекулярное моделирование структуры серотонинового 5-HT3 рецептора Попинако Анна Владимировна (Москва, popinako@rambler.ru) С модификациями в субъединицах серотонинового 5-HT3 рецептора связаны некоторые болезни, в частности: мигрень, неврологические заболевания шизофрения, депрессия, зависимость. Проведенные исследования помогут выяснить причины и механизмы развития болезней и найти путь их лечения в будущем.

Цель работы: определение трехмерной структуры серотонинового рецептора, изучение динамики взаимодействия надмембранной части рецептора с лигандами и миграции ионов в канале серотонинового 5-HT3 рецептора.

Материалы и методы: моделирование структуры по гомологии, управляемая (направленная) молекулярная динамика Результаты: надмембранная часть рецептора обогащена отрицательно заряженными остатками, что увеличивает селективность взаимодействия с транспортируемыми катионами. Структура поры серотонинового 5-HT3 рецептора гомологична аналогичной структуре никотинового ацетилхолинового рецептора (nAChR). Методами управляемой МД определено положение ворот канала (2,5 нм от надмембранного фрагмента) и дана оценка энергетического барьера ворот (~5 кДж/моль).

Рассмотрена динамика прохождения через канал катионов Na и Cs. Динамика движения Na+ неравномерна: имеются зоны торможения движения иона. В течение 20пс положительно заряженный ион Na+ локализуется в области остатков GLU 237, ASP 258. На прохождение катионов влияет также незаряженное лейциновое кольцо из остатков LEU 269, которые формируют ван-дер-ваальсовские ворота канала. Аналогичная картина наблюдается при миграции через мембранную часть рецептора Cs+ в водном окружении, но для цезия требуется большее время на преодоление зарядовых и стерических препятствий.

Определен потенциал средней силы (энергетический профиль канала), где учитываются особенности взаимодействия иона с молекулярными группами канала. При входе в канал имеется неглубокий энергетический минимум. Далее ион преодолевает энергетический барьер и попадает в потенциальную яму, сформированную взаимодействием с канальным окружением. Затем ион затягивается внутрь канала за счет электростатических эффектов.

При выходе из канала имеется также энергетический барьер, который преодолевается за счет трансмембранного потенциала и, возможно, за счет коллективных эффектов при вхождении в канал следующего иона.

Методика визуализации внутренней структуры клеток с помощью атомно-силовой микроскопии Роскошная Анна Сергеевна (Москва, annarosk@gmail.com) Микроскопические методы исследований являются основополагающими в гистологии и цитологии. Важнейшими из них являются оптическая микроскопия и – для получения высокого разрешения – просвечивающая электронная микроскопии (ПЭМ). Атомно-силовая микроскопия применяется для исследования гистологических препаратов чрезвычайно редко: стандартные способы подготовки образцов для АСМ позволяют исследовать поверхность образца, но не его внутреннюю структуру, поскольку игла кантилевера не проникает в объем исследуемого объекта.

Цель данной работы состоит в развитии экспериментальных методик, которые позволили бы проводить сканирование срезов тканей на атомно-силовом микроскопе (АСМ).

Предлагаемые новые методики визуализации клеточных препаратов используют иммобилизацию исследуемого материала в твердой среде и приготовление срезов, однако если для ПЭМ требуется приготовление ультратонкого среза, проницаемого для электронного пучка, то для АСМ значение имеет только сохранность поверхности после резки.

В данной работе показано, что на поверхности ультратонких срезов и блоков эпоксидной смолы сохраняется рельеф и неоднородность свойств, соответствующая препаратам, фиксированным в них. Объектами исследования являются изолированные кусочки ткани и клеточные культуры, они фиксируются, проходят процедуру фиксации, обезвоживания и заливаются в блоки эпоксидной смолы. Показано, что при использовании алмазного ножа поверхность для исследования получается более ровной, а рельеф – более информативным, чем при резке стеклянным ножом.

Предлагаемые методики были опробованы на образцах препаратов печени и селезенки крыс, меристемы корешка риса и культуры опухолевых клеток. На полученных изображениях видны структура клеток, хроматин ядер, цитоплазматические мембраны клеток, митохондрии и другие органеллы.

Исследования срезов на АСМ позволяет получать изображения, сопоставимые с малым увеличением просвечивающего электронного микроскопа. Дальнейшее развитие методик позволит использовать АСМ как дополнительный метод исследования тканей.

Определение степени гидролиза липосомальных фосфолипидов Санарова Екатерина Викторовна (Москва, sanarova8686@mail.ru) Применение липосомальных лекарственных форм в клинике требует разработки методов оценки их качества. В состав липосом часто входят фосфолипиды из группы фосфотидилхолинов, которые могут подвергаться различным физико-химическим превращениям, в результате чего нарушается целостность липосомальных везикул. Поэтому одним из параметров определения качественного состояния таких липосом является уровень гидролиза фосфотидилхолинов. В водной дисперсии липосом фосфотидилхолины могут быть гидролизованы до свободных жирных кислот, 2-ацил-лизофосфолипидов и 1-ациллизофосфолипидов. Лизофосфолипиды гидролизуются дальше до глицеро-фосфо соединений. Степень гидролиза часто определяется как отношение концентрации лизофосфолипидов к певоначальной концентрации фосфотидилхолинов в липосомах.

Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 || 10 | 11 |   ...   | 85 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.