WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 82 | 83 || 85 |

При переводе культур в среду без сыворотки, но в присутствии FGF, EGF и N2, происходило полное открепление клеток от подложки, где дальнейшее развитие культуры продолжалось в виде свободноплавающих сфер. Сферические агрегаты были представлены малодифференцированными Рах6 и нестин позитивными клетками. После стимуляции дифференцировки в культуре наблюдали многочисленные нестин, 3-тубулин, GFAP позитивные фибробластоподобные клетки, а так же обнаруживали единичные рековерин окрашенные, которые до этого не выявлялись.

В работе нами было показано, что РПЭ глаза взрослого человека проявляет тенденцию к дифференцировке в нервные клетки независимо от состава используемой среды, однако проявление мультипотентности зависит от наличия специфических факторов в среде культивирования. При этом РПЭ содержит несколько субпопуляций клеток, которые отличаются по способности к пластическим изменениям и ответом на наружные стимулы in vitro. Работа поддерживается грантом РФФИ 08.04.00081 и Контрактом Федерального агентства по науке и инновациям № 02.512.12.Исследование поведения трансплантированных ММСК в составе эксплантата сетчатки глаза, подвергшегося повреждению лазерным излучением Сергеев Сергей Александрович (Москва, embryossa@gmail.com) Современные представления о поведении трансплантированных стволовых клеток в нейрональных структурах при травме отводят решающую роль регуляторным факторам, выделяемым гибнущими клетками. Однако данное представление базируется на исследованиях целого организма, что не позволяет детально рассмотреть динамику морфологических изменений трансплантированных клеток, не дает возможности проследить за судьбой отдельных клеток в реальном времени. В противоположность исследованиям in vivo, трансплантация клеток in vitro в эксплантационную культуру лишена этих недостатков.

В качестве модели нами была выбрана сетчатка глаза новорожденных крыс Wistar.

Культивирование проводили в стандартных условиях в среде DMEM/F12 с FGF и EGF, 7% FCS. На 7-е сутки эксплантаты повреждали лазером Zilos-tk по квадрату со стороной мкм, и трансплантировали мезенхимные стромальные клетки костного мозга (ММСК).

ММСК выделяли из красного костного мозга большеберцовых костей GFP+ мышей, выращивали в клональной плотности или в культуре висячих капель для получения агрегатов и трансплантировали стеклянным микрокапилляром в концентрации 300-клеток в 0,2 мкл.

Было показано, что решающим для успешной миграции трансплантата к области повреждения является время, прошедшее после травмы. Так через сутки ММСК распространялись преимущественно диффузно, в то время как при инъекции сразу после травмы наблюдалась направленная миграция 70% трансплантированных ММСК в область повреждения эксплантата. На 2-е сутки ММСК утрачивали способность к быстрому перемещению, выпуская длинные нейритоподобные отростки и приобретая морфологию биполярных нейронов под действием нового клеточного окружения эксплантата сетчатки.

Было показано, что концентрация трансплантированных ММСК так же оказывает сильное влияние на интенсивность их миграции, которая значительно увеличивается с возрастанием плотности клеток в суспензии для инъекции. Отмечено распространение трансплантированных ММСК преимущественно по клеточным элементам сетчатки глаза и практически полное отсутствие живых клеток на поверхности культуральной чашки.

Пришедшие в область травмы клетки сохраняли свою жизнеспособность на протяжении более 30 суток. Но на протяжении всего времени эксперимента эксперссия характерных маркеров дифференцировки нервных клеток, трансплантированными ММСК так и не была выявлена.

Таким образом, удалось детально проследить судьбу клеток при трансплантации, показать решающую роль клеточного окружения для направленной дифференцировки и миграции.трансплантата, показать временную и пространственную зависимость эффективности миграции клеток в область повреждения, оценить минимальное количество клеток, способное мигрировать на большие расстояния в область травмы.

Закономерности развития клеточных и тканевых нейротрансплантатов Сухинич Кирилл Константинович (Москва, transpl@hotmail.com) Проблема регенерации в ЦНС млекопитающих и, в особенности, у человека является одной из центральных в нейробиологии. Причиной тому служат тяжелые последствия при заболеваниях и травмах головного и спинного мозга. Коррекция патологических состояний мозга является одной и главнейших задач, которая стоит сегодня перед нейробиологами.

Нейротрансплантация эмбриональной нервной ткани рассматривается в качестве одного из перспективных подходов в решении поставленной задачи. Однако на сегодняшний день остается не ясным, какой материал (клеточные суспензии, полученные путем диссоциации тканей эмбрионального мозга, или фрагменты эмбриональной нервной ткани) является наиболее предпочтительным для нейротрансплантации. Поэтому целью данного исследования было проведение сравнительного анализа приживления и развития клеточных и тканевых аллотрансплантатов эмбриональной нервной ткани мозга мышей 14-ти дневного развития, в клетках которых экспрессируется белок GFP.

Методика проведения эксперимента была следующая: фрагмент либо клеточную суспензию неокортекса эмбриона мыши 14-ти дневного развития трансплантировали в стриатум взрослого животного. Фиксация животных выполнялась через 7 и 30 суток после трансплантации. Мозг извлекали и резали на микротоме с замораживающим столиком.

Затем проводили иммуногистохимическое окрашивание антителами против GFAP, NeuN, PCNA, Tyrosine Hydroxylase.

Через 7 и 30 суток у экспериментальных животных были обнаружены трансплантаты по флуоресценции GFP. Тканевые трансплантаты, как правило, имели четкие границы, в отличие от клеточных. На 30 сутки происходит заметное увеличение размеров тканевых трансплантатов, тогда как изменения размеров клеточных трансплантатов менее выражены.

Наблюдалась миграция единичных клеток из трансплантатов в стриатум и кору. Наиболее обширная миграция в обоих случаях была обнаружена вдоль нервных волокон мозолистого тела. Вокруг клеточных и тканевых трансплантатов выявлялась глиальная реакция, снижающаяся на 30 сутки, что было обнаружено при окраске на GFAP, однако вокруг клеточного трансплантата глиальная реакция была выражена слабее. Наблюдалось снижение пролиферативной активности на 30 сутки, что было выявлено с помощью антител против PCNA – маркера пролиферирующих клеток. На 30 сутки после трансплантации были обнаружены дифференцированные нейроны по окраске антителами против NeuN. Глиальная дифференцировка клеток трансплантатов наблюдалась как на 7, так и на 30 сутки после операции в обоих случаях. Также было обнаружено врастание волокон и миграция астроцитов реципиента в трансплантат.

Таким образом, как тканевые, так и клеточные трансплантаты способны переживать не менее 30 суток без отторжения, при этом клетки в них дифференцируются в нейроны и глию. Однако, тканевые трансплантаты демонстрируют большую способность к росту.

Это, по-видимому, связано с более длительным сохранением эмбрионального микроокружения в тканевых трансплантатах в сравнении с трансплантатами диссоциированных клеток. Автор выражает признательность с.н.с. Подгорному О.В.

за помощь в подготовке данной работы.

Электронно-микроскопическое исследование нейроглиальных контактов в рецепторе растяжения рака Федоренко Ю.П., федоренко А.Г. (Ростов-на-Дону, forever277@mail.ru) Исследование нейроглиальных взаимодействий – одна из центральных проблем нейробиологии. Мы изучали ультраструктуру нейроглиальных контактов в рецепторе растяжения речного рака (РРР), состоящем из всего одного сенсорного нейрона и окружающих глиальных клеток (ГК). После изоляции рецептора растяжения и стабильной импульсации с частотой около 6-10 Гц препараты фиксировали глутаральдегидом, обрабатывали OsO4 и уранилацетатом и заключали в эпон. Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме Leica EM UC6 и исследовали на электронном микроскопе Tecnai Spirit 12.

Важным аспектом нейроглиальных взаимодействий является межклеточный транспорт веществ между нейроном и ГК. Он, вероятно, двухсторонний: из глии в нейрон и из нейрона в глию. Глиальная оболочка РРР состоит из 10-30 слоев. Глиальные отростки плотно прилегают к нейрону, так, что расстояние между их мембранами не более 10-15 нм.

Это облегчает диффузионный обмен между нейроном и ГК, но ограничивает сообщение нейрона с внешней средой. Особенностью механорецепторных нейронов является мощный слой микротрубочек, протягивающийся от дендритов к аксону. Он отделяет перикарион нейрона от плазмалеммы и затрудняет пузырьковый транспорт в/из ГК. Выпячивания цитоплазмы ГК в нейрон повышают прочность связывания глии с нейроном и облегчают перенос веществ из глии в нейрон. Они позволяют переносимым веществам преодолеть фибриллярный слой и достичь перикариона. В формировании инвагинаций участвуют триады: «подповерхностные уплощенные цистерны – цистерны эндоплазматического ретикулума – митохондрии». Уплощенные цистерны остаются связанными с изогнутым участком клеточной мембраны после формирования инвагинации. От инвагинаций могут отрываться пузырьки, ограниченные двумя мембранами. Они захватываются цитоплазмой нейрона. Так большие массы цитоплазмы ГК переносятся в нейроны. Также наблюдается транспорт аутофагосом, содержащих обломки органелл и даже целые органеллы, из нейрона наружу. Другая предполагаемая транспортная система – трубчатые решетки. Как правило, они располагаются в отдаленных глиальных слоях и не контактируют с нейроном.

Возможно, в рецепторе растяжения трубчатые решетки транспортируют поперек глиальных слоев ионы К+ и другие метаболиты. Таким образом, транспорт веществ из ГК в нейроны осуществляется с помощью диффузии, инвагинаций и связанных с ними триад:

«подповерхностные цистерны – свободные пузырьки – митохондрии». Перенос больших участков цитоплазмы глиальных клеток может происходить путем захвата внедрившихся в нейрон глиальных отростков. В межглиальном транспорте, вероятно, участвуют особые структуры - трубчатые решетки. Перенос участков цитоплазмы нейрона в глию может происходить в результате формирования аутофагосом.

Работа поддержана грантами РФФИ № 09-04-01322 и Минобрнауки РФ № 2.1.1/6185.

Механизмы взаимодействия мультпотентных мезенхимальных стромальных клеток с клетками почечных канальцев в условиях совместного культивирования Хряпенкова Татьяна Геннадьевна (Москва, tenella@list.ru) Способы взаимодействия различных клеток между собой всегда интересовали учёных.

А в связи с широким применением в последние годы клеточной регенеративной терапии этот интерес многократно возрос. В настоящее время заместительную клеточную терапию применяют при самых различных патологических состояниях. Для понимания механизмов клеточной терапии необходимо исследование на клеточном уровне контактных и дистантных взаимодействий клеток организма реципиента с трансплантированными клетками.

Целью данной работы было исследование механизмов взаимодействия мультпотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) с культивируемыми клетками почечных канальцев крыс.

Обнаружено, что между ММСК и клетками почки происходит образование межклеточных контактов, посредством которых клетки могут обмениваться внутриклеточным содержимым.

При цитометрическом исследовании клеток, нагруженных Mitotraсker, на разных сроках сокультивирования было обнаружено, что уже через 3 часа уменьшается интенсивность флуоресценции (ИФ) в нагруженной популяции и соответственное увеличение ИФ изначально неокрашенных клеток. Эта тенденция продолжала развиваться к 24 часам;

к 48 часам сокультивирования пики обеих популяций практически сливались. Таким образом, ММСК передают окрашенные Mitotraсker митохондрии в клетки почки.

Аналогично исследовался обмен цитоплазматическим содержимым и мембранными компонентами. Было обнаружено, что сразу после смешивания в культуре выделяются две популяции с разной ИФ Calcein или DiO: неокрашенные клетки почки попадают в популяцию с низкой ИФ, а клетки, несущие зонд – в пик с высокой. При сокультивировании происходит уменьшение обеих начальных популяций и появление большого числа клеток с промежуточными значениями ИФ. В случае с Calcein через 6 часов доля таких клеток составляла 19,4%, через 24 часа – 32%, а через 48 часов – более 38% всей культуры. При окрашивании мембранных липидов DiO через 6 часов доля таких клеток составляла 14,7%, а через 24 часа и 48 часов – около 45% всей культуры. Мы считаем, что увеличение числа клеток со средней ИФ, то есть транспорт флуоресцентных зондов, отражает перенос компонентов цитоплазмы или мембран из ММСК в неокрашенные клетки почки.

Можно сделать вывод, что в смешанной культуре образуются межклеточные контакты, способные осуществлять транспорт митохондрий и различных цитоплазматических и мембранных компонентов.

Работа поддержана грантами РФФИ № 08-04-01667 and 09-04-13663-офи_ц. Хочу поблагодарить руководителя лаборатории структуры и функций митохондрий НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского и научного руководителя – Зорова Дмитрия Борисовича; научного руководителя Плотникова Егора Юрьевича; а также всех сотрудников нашей лаборатории.

Исследование морфологических особенностей стабильных и нестабильных атеросклеротических поражений сонных артерий в сопоставлении с УЗДГ обследованием, неврологическим статусом пациента в анамнезе и цитокиновым профилем плазмы Шишкина В.С., Каширина С.В. (Москва, shishkinavalya@mail.ru) Острые клинические проявления сердечнососудистых заболеваний связаны с развитием нестабильных (склонных к разрывам) атеросклеротических поражений стенок магистральных артерий. Разрыв нестабильной каротидной бляшки может привести к острому нарушению мозгового кровообращения (ОНМК), транзиторной ишемической атаке (ТИА) и в итоге к инсульту. В связи с этим важна возможность точного диагностирования нестабильности бляшки неинвазивными методами. Целью этого исследования стало сопоставление структурно-морфологических изменений атеросклеротических бляшек сонных артерий с данными УЗДГ обследования и с данными цитокинового профиля плазмы.

В работе использовали 35 биопсий сонных артерий, полученных у пациентов в результате операции каротидной эндартерэктомии. Срезы окрашивали гематоксилином-эозином, по Ван-Гизону, орсеином, альциановым синим. Результаты окрашивания оценивали полуколичественно, морфометрические измерения проводили в программе ImageJ.

Pages:     | 1 |   ...   | 82 | 83 || 85 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.