WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 6 | 7 || 9 | 10 |   ...   | 85 |

Гемолитическую активность пептидов оценивали по вытеканию гемоглобина при инкубации с эритроцитами человека in vitro. Активность укороченного аналога в отношении эритроцитов оказалась снижена по сравнению с исходным пептидом в 8 раз. Это согласуется с опубликованными ранее данными о том, что N-концевой участок Ltc1K погружен в гидрофобную область мембраны. Следовательно, его удаление может снижать сродство пептида к мембране эукариотической клетки. Эксперимент на модельных липидных системах показал, что удаление 3 N-концевых остатков снижает в 8 раз аффинность пептида к цвиттерионным мембранам, а на пермеабилизующую способность пептида влияния не оказывает. Было высказано предположение, что уменьшение гемолитической активности Ltc1K при его укорочении обусловлено только снижением сродства пептида к незаряженному фосфолипидному бислою. С помощью метода лазерной сканирующей конфокальной микроскопии мы сравнили механизм действия пептидов на мембрану эритроцитов. Было показано, что лизис сопровождается прохождением эритроцитов через одинаковые морфологические стадии (дискоцит-эхиноцит-сфероцит-стоматоцит-«тень») в обоих случаях. Размеры образуемых дефектов оценивали по проникновению флуоресцентно-меченых декстранов разного диаметра внутрь «теней». Оба пептида могут формировать устойчивые во времени поры, средний размер которых сильно зависит от концентрации добавляемого пептида. Выявлено, что при эквиэффективных гемолитических концентрациях размер пор одинаковый. Таким образом, полученные данные подтверждают гипотезу о том, что пептиды взаимодействуют с эукариотической мембраной по одинаковому механизму, а все выявленные различия являются лишь следствиями различий в мембранной аффинности.

Проведенное сравнительное исследование существенно проясняет картину взаимодействия антибактериального пептида Ltc1K c клетками эукариот и послужит необходимой теоретической базой для возможных дальнейших исследований в этой области.

Регуляция хинонами редокс-состояния фагоцитов крови и клеток глиомы Кулагова Т.А., Крылова Н.Г. (Белоруссия, Минск, tatyana_kulagova@tut.by) Одной из характеристик клеточного гомеостаза является редокс-состояние или окислительно-восстановительный баланс клетки, который поддерживается благодаря сопряжённому функционированию систем образования и утилизации редокс-агентов, а также мембранных систем транспорта различных типов окислителей и восстановителей в клетке. Редокс-состояние клеток может меняться при воздействии на них редокс-активных молекул, в частности, хинонов. При действии хинонов изменение редокс-состояния клеток может произойти как за счет накопления окислителей (взаимодействие семихинонов с молекулярным кислородом с образованием активных форм кислорода (АФК)), так и за счет накопления восстановителей-антиоксидантов (двухэлектронное восстановление хинонов).

Следовательно, вмешательство хинонов в редокс-процессы несомненно отразиться на проявлении функциональных свойств клеток. С целью выявления регулирующего действия хинонов на свойства клеток были изучены процессы генерации АФК моноцитами и нейтрофилами крови в присутствие бензо- и нафтохинонов, а также хинониндуцированное образование АФК в клетках опухоли (глиомы) с использованием методов хемилюминесцентного и флуоресцентного анализа.

Установлено, что при добавлении менадиона, лавсона, юглона, коэнзима Q10 в диапазоне концентраций от 1·10-6 моль/л до 1·10-4 моль/л к мононуклеарам и нейтрофилам, адгезирующим к стеклу, количество генерируемых клетками АФК уменьшается.

Следовательно, данные хиноны проявляют антиоксидантные свойства при генерации АФК фагоцитами, стимулированными адгезией к стеклу. Присутствие коэнзима Q10 в диапазоне концентраций от 1·10-9 моль/л до 1·10-4 моль/л не влияет на активацию кислорода фагоцитами. Выявлено, что при добавлении менадиона и викасола к клеткам глиомы линии С6 и линии U251 образуются АФК с преобладающим вкладом супероксидных анионрадикалов и пероксида водорода, то есть индуцируется окислительный стресс. Количество образующихся в клетках глиомы АФК зависит от концентрации хинонов. С использованием ингибиторного анализа выявлено, что в клетках глиомы менадион подвергается одно- и двухэлектронному восстановлению внутриклеточными редуктазами. Образование АФК при действии менадиона на клетки линии С6 осуществляется при участии NO-синтаз, НАДН:убихинон-оксидоредуктазы электронтранспортной цепи митохондрий, протеинкиназы С, ERK1/2 и ферментов метаболизма эндогенной арахидоновой кислоты, включающих активацию фосфолипазы А2 и 5-липоксигеназы, но не циклооксигеназ.

Результаты проведенных нами экспериментов позволяют заключить, что хиноны можно рассматривать как регуляторы редокс-состояния клеток. Поскольку при действии на клетки, которые при функционировании в организме генерируют АФК, хиноны выступают в роли антиоксидантов, а при добавлении к клеткам, в которых содержится большое количество антиоксидантов, в частности, к клеткам глиомы, они индуцируют окислительный стресс.

Нанокомпозит на основе кристаллов кремния и фуллереновой фазы – новый фотосенсибилизатор с выраженным цитостатическим эффектом на опухолевые клетки Курмышкина Ольга Вадимовна (Петрозаводск, VolkovaTO@yandex.ru) Проблема формирования наночастиц для прицельного воздействия на биологические мишени решается путем использования нанопористых полупроводников и их нанокомпозитов с молекулами фуллеренов С60 и С70, обеспечивающих высокоэффективную генерацию возбужденных состояний синглетного кислорода.

Синглетный кислород и ряд других кислород-содержащих радикальных молекул играют важную роль в регуляции процессов жизнедеятельности организмов. Кроме того, показано, что синглетный кислород может быть использован как мощный оксидант биомолекул для лечения онкопатологий (метод фотодинамической терапии). При этом нанореакторы являются наиболее эффективным способом формирования синглетного кислорода в локальной области злокачественных новообразований.

Нами было изучено цитостатическое действие нанокомпозита кристаллов кремния с адсорбированными молекулами фуллерена С60 на клетки фибросаркомы человека НТ-1080.

Нанокомпозит создан на кафедре физики твердого тела Петрозаводского государственного университета (зав. кафедрой д.ф-м.н., проф. Гуртов В.А.). Там же получены результаты, касающиеся особенностей переноса энергии в системе наноструктурированный кремний – фуллерены и позволяющие сделать вывод об эффективной генерации синглетного кислорода в данном нанокомпозите. Нами показано, что разработанный нанокомпозит обладает по отношению к клеткам НТ-1080 выраженным цитостатическим действием: к 5-ым суткам экспозиции количество жизнеспособных опухолевых клеток в культуре составляло всего 10–12%, тогда как определяемый показатель клеток, обработанных только нанокристаллами кремния, находился на уровне 32–35%. Культивирование клеток с чистыми фуллеренами снижало их жизнеспособность до 60–63%. Жизнеспособность необработанных клеток в культурах была порядка 95–97%. Все культуры после внесения реагентов в течение часа подвергались воздействию видимого света. Таким образом, создание подобных фотосенсибилизаторов представляется весьма перспективным подходом к разработке препаратов нового поколения для фотодинамической терапии опухолей.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта НШ-306.2008.4.

Изучение внутриклеточной локализации in vitro и in vivo модульного нанотранспортера для адресной доставки лекарств Лупанова Т.Н., Сластникова Т.А. (Москва, tatyanalupanova@yandex.ru) Многие противораковые лекарства являются локально-действующими и должны быть доставлены в определённый клеточный компартмент раковой клетки. В нашей лаборатории был разработан ряд модульных нанотранспортеров (МНТ) для направленной доставки локально действующих лекарств в заданный компартмент клетки-мишени. В основу их работы заложены естественные клеточные механизмы транспорта и сортировки макромолекул. МНТ включают в себя следующие модули: -меланоцит-стимулирующий гормон (МСГ) или эпидермальный фактор роста (ЭФР) в качестве интернализуемого лиганда; оптимизированный сигнал ядерной локализации (СЯЛ) большого Т-антигена вируса SV-40, обеспечивающий транспорт в ядро; HMP (гемоглобиноподобный белок E.coli) как модуль-носитель; транслокационный домен дифтерийного токсина (ДТокс), в качестве эндосомолитического модуля.

Целью данной работы было изучение внутриклеточного распределения модульного нанотранспортера in vitro и in vivo.

Для достижения данной цели были экспрессированы в клетках E.coli, выделены и аффинно очищены полипептиды (Гис)6-ДТокс-HMP-СЯЛ-МСГ и (Гис)6-ДТокс-HMP-СЯЛЭФР. Для восстановления дисульфидных связей в ЭФР проводился рефолдинг полипептида (Гис)6-ДТокс-HMP-СЯЛ-ЭФР.

Исследование внутриклеточной локализации МНТ in vitro было проведено на клетках меланомы мышей линии B16F1, характеризующихся повышенной экспрессией меланокортиновых рецепторов, и клетках эпидермоидной карциномы человека линии Aс повышенной экспрессией рецепторов эпидермального фактора роста.

Методом конфокальной сканирующей микроскопии и непрямого иммуногистохимического окрашивания показано, что уже через 3 часа после инкубации исследуемые МНТ проникают в клетки и обнаруживаются в ядрах. Были подобраны условия, при которых уровень автофлуоресценции клеток и неспецифического связывания антител был крайне низок.

Ранее в нашей лаборатории на ряде раковых клеток в культуре также была показана ядерная локализация транспортера. Однако ситуация in vivo нередко значительно отличается от наблюдаемой in vitro, поэтому нами было исследовано распределение МНТ в клетках опухоли in vivo. Уже через 3 часа после внутривенного введения ЭФР-содержащего МНТ в дозе 3 мг на мышь Balb/c ByJIco nu/nu с привитой опухолью A431 методом непрямого иммуногистохимического окрашивания полутонких срезов и конфокальной сканирующей микроскопии МНТ выявлялся не только в цитоплазме, но и в ядрах опухолевых клеток.

Таким образом впервые показано, что уже через 3 часа после системного введения исследуемые МНТ проникают в опухолевые клетки и обнаруживаются в ядрах не только in vitro, но и in vivo.

Установление термодинамических характеристик взаимодействия метилрезорцина с лизоцимом для целенаправленного регулирования ферментативной активности Мартиросова Елена Игоревна (Москва, ms_martins@mail.ru) Установлено, что один из химических аналогов микробных регуляторных факторов, С7-АОБ (метилрезорцин), относящийся по природе к алкилоксибензолам (АОБ), способен увеличивать каталитическую активность гидролаз, а также влиять на их функциональную стабильность. На примере лизоцима было показано, что его модификация молекулами С7-АОБ в диапазоне концентраций 0,2-2,0 мг/мл влечет за собой повышение активности фермента в отношении специфического субстрата, пептидогликана, до 200% и в отношении неспецифического субстрата, коллоидного хитина, до 470%.

Для понимания физико-химической природы выявленных эффектов было изучено влияние концентрации С7-АОБ на термодинамические параметры взаимодействия ферментАОБ в растворе на примере модельной системы «лизоцим белка куриного яйца - С7-АОБ» в 0,05М фосфатном буфере (рН 7,4) при 37°С.

Термодинамической функцией, непосредственно отражающей преобладающий характер взаимодействий белок-АОБ в водной среде, является энтальпия взаимодействий (Hb), которую определяли методом изотермической микрокалориметрии смешения. Установлено, что Hb является отрицательной величиной, значение которой уменьшается от 0 до –кДж/моль с увеличением концентрации С7-АОБ от 0 до 35 мМ. Отрицательные значения Hb указывают на преобладание в системе экзотермических взаимодействий, обусловленных, вероятно, образованием водородных связей между гидроксильными группами С7-АОБ и полярными группами молекулы лизоцима. На основании полученной изотермы определены стандартные термодинамические функции связывания (Hb0 = -9,6 кДж/моль; Sb0 = -3,8 Дж/(моль·К); Gb0 = -8,5 кДж/моль).

Методом статического лазерного светорассеяния в той же системе установлено двукратное повышение значения второго вириального коэффициента взаимодействий белокбелок в результате взаимодействия с С7-АОБ. Это свидетельствует о повышении термодинамического сродства молекул лизоцима к растворителю под действием С7-АОБ.

Полученный результат коррелирует с наблюдавшимся ранее методом адиабатной сканирующей микрокалориметрии (ДСК) эффектом двукратного повышения разности теплоемкостей нативной и денатурированной форм молекул модифицированного с использованием С7-АОБ лизоцима в сравнении с интактным белком.

Ранее также методом ДСК нами было установлено, что избыточная свободная энергия денатурации лизоцима в той же системе понижается с увеличением концентрации с С7-АОБ на 10 кДж/моль и этот эффект коррелирует с повышением неспецифической каталитической активности лизоцима.

Совокупность полученных данных позволяет предположить, что эффект метилрезорцина на каталитическую активность лизоцима в отношении неспецифического субстрата (коллоидного хитина) в изученной системе проявляется как в повышении скорости реакции гидролиза, так и в повышении сродства лизоцима к субстрату.

Ослабление кислород-независимых реакций нейтрофилов под воздействием квантовых точек Михеева Эльза Равилевна (Нижний Новгород, biomikheeva@gmail.com) Лизосомально-катионные белки (ЛКБ) полиморфно-ядерных лейкоцитов принимают активное участие в реализации всех эффекторных функций нейтрофильных гранулоцитов.

Поэтому лизосомально-катионный тест широко используются в качестве диагностического критерия многих заболеваний инфекционной природы. В представленной работе он впервые используется для оценки влияния на нейтрофильные гранулоциты принципиально нового класса соединений – квантовых точек. Квантовые точки являются перспективным флуорофором, обладающим целым рядом несомненных преимуществ перед традиционными (высокий квантовый выход, устойчивость к фотоблитчингу, хороший спектр эмиссии и т.д.).

Нейтрофильные гранулоциты выделяли из венозной крови здоровых доноров на двойном градиенте фиколл-урографина. Квантовые точки трех типов: CdSe/ZnSмеркаптопропионовая кислота (МПК), (CdSe/CdZnS)ZnS-polyT, CdSeCdSZnS/polyT/SiO2-NH(НТИЦ «Нанотех-Дубна», г. Дмитров) брали в конечной концентрации 0,1 мг/мл. Клетки инкубировали с квантовыми точками в течение 60 мин при 37°С. Цитохимическое исследование ЛКБ нейтрофилов проводили по методу В.Е. Пигаревского.

Pages:     | 1 |   ...   | 6 | 7 || 9 | 10 |   ...   | 85 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.