WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 85 |

Исследование фаз нефотохимеского тушения флуоресценции индуцированных светом высокой интенсивности у зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii и диатомовой водоросли Thalassiosira weissflogii с использованием PEA флуорометра Колачева Анна Алексеевна (Москва, kufiya@inbox.ru) В настоящее время экологический мониторинг широко используется для оценки состояния фитопланктона, а также наземных растений. Измерение флуоресценции хлорофилла являются дешевым в эксплуатации, высокочувствительным методом позволяющим оценивать физиологическое состояние растений в режиме реального времени, благодаря чему эти методы получили применения в экологическом мониторинге. Недавно был разработан метод измерения и анализа индукционных кривых флуоресценции (ИКФ) индуцированных высоким по интенсивности светом (OJIP кривая). В настоящее время исследованы механизмы быстрой фазы ИКФ, связанных с изменением фотохимечского тушения флуоресценции (до 1 с), в то время как медленные фазы кинетики (от 1 с до минут), связанные с нефотохимическим тушением флуоресценции исследованы недостаточно, в том числе у водорослей. Как известно нефотохическое тушение связано в основном с ростом тепловой диссипации энергии в антенне фотосистемы II (pH зависимые механизмы, ксантофилловый цикл), а также с переходом фотосинтетических мембран из состояния 1 (высокая скорость возбуждения реакционного центра фотосистемы II) в состояние 2 (низкая скорость возбуждения реакционного центра фотосистемы II) (Рубин, Кренделева, 2003).

В данной работе мы исследовали различные фазы нефотохимического тушения флуоресценции на ИКФ используя специфические разобщители и ингибиторы: FCCP – разобщитель трансмембранного протонного градиента; валиномицин – разобщитель электрического градиента; этилмалеимид – ингибитор перехода мембран из состояния 1 в состояние 2; дитиотреитол- ингибитор ксантофиллового цикла. ИКФ возбуждались светом интенсивностью 3000 E m-2s-1 в течение 5 минут у зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii и диатомовой Thalassiosira weissflogii с использованием флуорометра Handy Pea.

Кроме того проводили измерения кинетик замедленной флуоресценции с использованием фосфороскопа, созданного на кафедре биофизики МГУ.

По результатам работы были определенны механизмы, которые обуславливают развитие тех или иных фаз нефотохимического тушения флуоресценции на кинетиках индукции флуоресценции у Chlamydomonas reinhardtii и Thalassiosira weissflogii.

Исследование участия фосфатидилинозитол 3-киназы, протеинкиназы В/Akt и киназы гликогенсинтазы-3beta в реакции нейронов и глиальных клеток рака на фотодинамическое воздействие Командиров М. А., Князева Е.А. (Ростов-на-Дону, mkomandirov@yandex.ru) Фотодинамическое (ФД) воздействие, применяющееся для лечения рака, основано на развитии окислительного стресса в окрашенных клетках при освещении и в итоге некротической или апоптозной смерти. Эти процессы контролируются внутриклеточной сигнальной системой. Важную роль в выживаемости клеток может играть сигнальный путь с участием фосфатидилинозитол 3-киназы, протеинкиназы В/Akt и киназы гликогенсинтазы3beta (PI3K/Akt/GSK-3beta). Для изучения его участия в ФД повреждении нейронов и окружающих глиальных клеток (ГК) в изолированном рецепторе растяжения рака использовались LY294002 (10 мкМ) и вортманнин (120 нМ), ингибиторы PI3K, Akt inhibitor IV (AktI, 1 мкМ), ингибитор протеинкиназы B/Akt, и TDZD-8 (2 мкМ), ингибитор GSK-3beta.

Фотосенсибилизатор – алюмофталоцианин Фотосенс, источник света – полупроводниковый или He-Ne лазеры (670 или 633 нм). Нейронную активность отводили внеклеточно присасывающимися электродами и регистрировали с помощью программно-аппаратного комплекса на базе персонального компьютера. Некроз и апоптоз определяли путем двойного флурохромирования препарата пропидиум-иодидом, выявляющим ядра некротических клеток, и Hoechst-33342, выявляющим фрагментированные ядра апоптозных клеток.

В темноте ингибирование PI3K или Akt не влияло на некроз нейронов и ГК и на апоптоз ГК.

TDZD-8, ингибитор GSK-3beta, втрое усиливал апоптоз и вдвое – некроз ГК, что указывает на защитную роль GSK-3beta в нервной системе рака. Фотосенс или лазерное излучение поотдельности не влияли на нейронную активность, но вместе (это ФД воздействие) вызывали сначала активацию, а затем торможение и необратимое прекращение нейронной активности в среднем за 15-20 мин. После этого развивался некроз нейронов, некроз и апоптоз окружающих ГК. При фотосенсибилизации ингибирование PI3K с помощью LY294002 или вортманнина, как и ингибирование GSK-3beta с помощью TDZD-8, не вызывало достоверного изменения уровня фотоиндуцированных апоптоза и некроза ГК или некроза нейронов. Это свидетельствует о неучастии PI3K и GSK-3beta в данных процессах.

Ингибитор AktI не влиял на импульсную реакцию нейрона и апоптоз ГК, но вдвое снижал уровень ФД-индуцированного некроза нейронов и ГК, т.е. протеинкиназа В/Akt участвовала в ФД-индуцированном некрозе нейронов и глиальных клеток. Это могло быть связано с Akt-опосредованной генерацией активных форм кислорода в этих клетках.

Работа поддержана грантами РФФИ (09-04-01322) и Минобрнауки РФ (2.1.1/6185).

Влияние затемнения на уровень экспрессии гена фосфолипазы D в однодольных и двудольных растениях Крывуля Ирина Анатольевна (Белоруссия, Минск, ira.kryvulia@gmail.com) Основным ферментом фосфолипидного катаболизма в растениях является фосфолипаза D (ФлD). В условиях затемнения ФлD участвует в обеспечении энергетических потребностей клетки путем гидролиза фосфолипидов, продукты которого затем вовлекаются в углеводный обмен, способствуя тем самым адаптации растений к недостаточному уровню освещенности.

Известно, что ферментативная активность ФлD зависит от световых условий выращивания растений. Однако до настоящего времени оставалось неясным, каков механизм светового контроля активности фермента ФлD. Для выяснения возможности регуляции на транскрипционном уровне, оценивали влияние световых условий роста растений на содержание в их тканях транскриптов гена ФлD с помощью метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Исследования проводились на проростках растений томата и овса, выращенных в различных световых условиях. Были разработаны генспецифические пары праймеров для генов - и -изоформ ФлD томатов (на основании известных последовательностей мРНК ФлD томатов), а также для гена ФлD овса. Следует отметить, что для овса нуклеотидная последовательность гена ФлD до сих пор не установлена, поэтому дизайн праймеров осуществлялся на основе последовательностей генов ФлD других злаковых: риса, кукурузы, ячменя. Секвенирование ДНК-фрагментов, полученного в ходе ОТ-ПЦР с помощью разработанной пары, показало, высокий (97%) уровень сходства нуклеотидной последовательности с генами ФлD других видов злаковых и, в то же время, не выявило сходства с генами других белков. Таким образом, в результате секвенирования ампликонов, полученных с помошью этой пары праймеров, впервые была получена нуклеотидная последовательность фрагмента гена ФлD овса.

При исследованиях на растениях томата, применялись различные варианты режимов выращивания. 1) этиолированные проростки томатов; 2) зеленые проростки; 3) зеленые проростки после 1, 2, 3 и 4 суток затемнения. В них оценивался относительный уровень экспрессии гена ФлD – R. В качестве контроля использовались зеленые растения соответствующего возраста. Эксперименты проводились на растениях разного возраста:

проростки через 2–3 дня после всходов, двухнедельные проростки (считая с момента всходов), полуторамесячные растения. Однако проведенные эксперименты не выявили четкой зависимости R генов исследуемых изоформ от режима освещения и затемнения.

Аналогичные эксперименты были проведены на зелёных и этиолированных проростках овса. В результате не было обнаружено существенного изменения R гена ФлD в зависимости от условий освещенности, что дает основание говорить о том, что выявляемая с помощью разработанной нами пары праймеров экспрессия изоформы гена ФлD овса не зависит от световых условий.

Полученные результаты дают основания полагать, что гены исследуемых изоформ ФлD томатов и овса не подвержены фотомодуляции и свидетельствуют в пользу посттранскрипционных механизмов контроля ферментативной активности ФлD.

Исследование упорядоченности микроструктуры глаза мушек Drosophila melanogaster методом атомно-силовой микроскопии Крючков М.В., Сергеев А.В. (Пущино, Kryuchkov_mih@mail.ru) Фасеточный глаз насекомых состоит из высокоупорядоченных омматидиев. Линза омматидия имеет антибликовое покрытие, но молекулярные механизмы его образования неизвестны.

Нами был поставлен метод исследования поверхности глаза методом атомно-силовой микроскопии. Разработанный нами подход отличается простотой приготовления образца и быстротой получения результатов. В результате впервые были получены изображения микроструктуры омматидия дрозофилы, отличающиеся высоким разрешением. Благодаря хорошей детализации поверхности нами был проведен подробный анализ с использованием современного программного обеспечения. Фурье-анализ морфологии поверхности выявил наличие периодичности микроструктуры омматидия.

Нами была выдвинута гипотеза о том, что PCP (planar cell polarity), как путь, обуславливающий высокую упорядоченность структуры глаза, может также влиять и на формирование антибликовой поверхности. Для проверки гипотезы были исследованы различия микроструктуры омматидиев мушек дикого типа и мутантных по Frizzled рецептору (участвующему в PCP пути).

Анализ полученных изображений показал, что зернистые структуры поверхностей омматидиев имеют одинаковую плотность распределения и практически идентичные периоды как для мух дикого типа, так и для мутантных по Frizzled рецептору. Элементарная ячейка, характерная для кристаллических структур, выявлена не была.

Поставленный нами метод дает мощный инструмент для будущих исследований и может быть использован для решения широкого круга задач.

Выражаю благодарность коллективу группы физики нуклеопротеидов Института белка РАН за межлабораторное сотрудничество, в рамках которого была выполнена работа.

Биологический эффект галоид-производных антрацена:

влияние на биохимические реакции, взаимодействие с белками Кудряшева Галина Александровна (Красноярск, gusya@nm.ru) Исследование биологического эффекта галоидсодержащих веществ является актуальной задачей, поскольку, с одной стороны, галогенированые соединения – это необходимые составляющие живых организмов, а с другой, многие из них – сильнодействующие токсиканты (Williams et al., 2003). Транспорт, активация таких веществ часто осуществляется посредствам взаимодействия с белковыми молекулами. Данная работа посвящена выявлению зависимости степени воздействия галогенированных соединений на биохимические процессы от массы галоида в их составе.

Целью работы являлось изучение влияния ряда гомологичных соединений с увеличивающейся массой галоидного заместителя (антрацен, 9-хлороантрацен, 9-бромоантрацен, 9-йодоантрацен) на ферментативные реакции на примере биолюминесцентной реакции бактерий.

Были зарегистрированы характеристики (спектр, кинетика, максимальная интенсивность) биолюминесценции биферментной системы NAD(P)H:FMN-оксидоредуктаза-бактериальная люцифераза в присутствии разных концентраций антраценов. Установлено, что эффективная концентрация воздействия красителей (при которой максимальная интенсивность уменьшается на 50%) увеличивается с ростом массы галоидного заместителя. Для оценки воздействия галогенированных антраценов на ферменты было исследовано их взаимодействие с модельным белком – сывороточным альбумином быка (БСА). Были измерены спектры возбуждения и испускания, а также анизотропия люминесценции антраценов в присутствии и отсутствии БСА. Константу диссоциации комплекса БСАкраситель рассчитывали, используя изменения анизотропии флуоресценции антраценов при связывании с белком (Lakowicz, 2006). Зарегистрировано увеличение квантового выхода антраценов при связывании белком. Получены константы диссоциации комплекса БСАкраситель в диапазоне 2,3·10-6–9·10-5 М, монотонно уменьшающиеся с ростом массы галоида в составе антрацена.

Таким образом, установлено, что с ростом массы галоидного заместителя усиливается ингибирующее действие галогенированных антраценов на биолюминесцентную реакцию, что, возможно, объясняется усилением взаимодействия антраценов с белками, приводящим к инактивации ферментов.

Влияние N-концевого участка антибактериального пептида Ltc1K на гемолитическую активность Кудряшова Ксения Сергеевна (Москва, rekamoskva@mail.ru) В последние годы наблюдается рост устойчивости патогенных микроорганизмов к действию известных антибиотиков. Проблема поиска новых антибактериальных агентов становится все более актуальной. Антимикробные пептиды обнаружены у различных по происхождению организмов и, по видимому, являются частью защитной системы. Многие из них обладают высокой антибактериальной и низкой цитотоксической активностью, поэтому могут рассматриваться как перспективные антибактериальные агенты при создании новых лекарств.

Изучение влияния структуры пептидов на характер их взаимодействия с про- и эукариотическими клетками, в том числе с использованием мутантных форм, необходимо для создании синтетических аналогов, обладающих заданным набором свойств.

В данной работе был проведен сравнительный анализ гемолитической активности и характера взаимодействия с мембраной линейного катионного пептида латарцина Ltc1K из яда среднеазиатского паука Lachesana tarabaevi (SMWSGMWRRKLKKLRNALKKKLKGEK) и его укороченного на 3 аминокислоты с N-конца аналога Ltc1.2.

Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 85 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.