WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 85 |

Спектры кругового дихроизма цитохром с - оксидазы и их интерпретация на основе классической теории оптической активности Дюба Артем Владимирович (Москва, dyubon@gmail.com) Цитохром c-оксидаза — один из ключевых ферментов аэробного дыхания, служащий генератором протонного потенциала. Предметом многих исследований служит механизм сопряжения электронного и протонного транспорта в этом ферменте. Среди экспериментальных методов изучения этой проблемы особое место занимает спектроскопия кругового дихроизма (КД). Этот метод позволяет оценить симметричность поглощающей молекулы. Если молекула не имеет ни центра инверсии, ни плоскости симметрии, то она неодинаково поглощает правополяризованные и левополяризованные световые волны и называется оптически активной. Оптическая активность цитохром с-оксидазы в ближней УФ и видимой области спектра (400-600 нм) связана с наличием двух гемов, низкоспинового гема а и высокоспинового гема a3, имеющих полосы поглощения в этих областях спектра, а также расположенных вблизи них ароматических аминокислотных остатков. Спектры КД могут оказаться чувствительны к изменению состояния как самих гемов, так и их ближайшего окружения, например, функционально важных аминокислотных остатков.

Несмотря на то, что спектры КД цитохром с-оксидазы были экспериментально зарегистрированы, теоретического объяснения наблюдаемой формы спектра и положений максимумов на нем не было предложено.

В настоящей работе приводятся полученные нами спектры КД и поглощения цитохромоксидазы в различных редокс-состояниях и предлагается модель, позволяющая на основе данных 3D-структуры (PDB:1V54, 1V55) выяснить факторы, обуславливающие наблюдаемый сигнал КД цитохром с-оксидазы. Модель основана на классической теории оптической активности.

При моделировании спектров поглощения и КД восстановленной и окисленной форм цитохром с-оксидазы было установлено, что взаимодействие двух гемов не может объяснить наблюдаемую величину и форму сигнала. Основной вклад в оптическую активность, обуславливающий наблюдаемый вид спектра, дает взаимодействие гемов с находящимися вблизи них остатками ароматических аминокислот.

Силовая спектроскопия живых клеток Ефремов Юрий Михайлович (Москва, yu.efremov@gmail.com) В последнее время атомно-силовая микроскопия (АСМ) все чаще применяется для исследования биологических материалов. Это обусловлено ее преимуществами перед другими видами микроскопии, в том числе высоким пространственным разрешением и возможностью проведений измерений в жидкости (что позволяет ставить эксперименты в условиях, близких к нативным).

Изучение живых клеток методом АСМ может быть выделено в отдельное узкое направление, его обособленность связана с тем, что живые клетки являются очень мягким и подвижным объектом. Кроме измерения топографических характеристик, АСМ позволяет определять локальные неоднородности механических свойств, это делается с помощью силовой спектроскопии. В данной работе этот метод был применен для исследования клеток органотипической культуры DRG (dorsal root ganglion), выделенной из эмбрионов цыплят.

Были получены изображения клеток на оптическом и атомно-силовом микроскопах, при этом использовались различные режимы АСМ (контактный, полуконтактный, контактный метод рассогласования, метод фазового контраста). Выяснилось, что при проведении измерений в контактном режиме упругие элементы цитоскелета заметны лучше, чем в полуконтактном. Были проведены эксперименты по оценке модуля Юнга: он составил от до 40 кПа, эти значения примерно совпадали при использовании кантилеверов разной жесткости. Было показано, что экспериментально измеряемые значения модуля Юнга существенно зависят от способа обработки данных и выбранной модели взаимодействия, описывающей взаимодействие между зондом и клеткой.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы, ГК № П717. Автор выражает благодарность Е.В. Дзюбенко за предоставленные образцы.

Комплексное исследование везикулярного цикла в нервно-мышечных синапсах Захаров Андрей Викторович (Казань, mphiszav@rambler.ru) В данной работе проведено исследование экзо- эндоцитоза и рециклирования синаптических везикул в нервных окончаниях кожно-грудинной мышцы лягушки и диафрагмальной мышцы мыши при длительном раздражении с частотой 20 имп/с. Для регистрации потенциалов концевой пластинки применяли внутриклеточное микроэлектродное отведение. Динамику эндоцитоза в процессе высокочастотной активности синапса исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием красителя FM1-43 (применяли поминутную аппликацию FM1-43). Полученные данные положены в основу математических моделей везикулярных циклов в указанных объектах.

Экспериментальные наблюдения и результаты математического моделирования позволяют заключить, что в двигательных нервных окончаниях лягушки в секреции медиатора участвуют три пула синаптических везикул, которые восполняются посредством двух видов эндоцитоза: быстрого, имеющего ограниченную пропускную способность, и медленного. Быстро рециклирующие везикулы пополняют мобилизационный пул, а резервный пул восстанавливается за счёт медленного эндоцитоза. Модельное исследование также показало, что в нервных окончаниях лягушки везикулы резервного и мобилизационного пулов вовлекаются в секрецию медиатора независимо, т.е. параллельно.

Экспериментальные данные на нервно-мышечных препаратах мыши воспроизводятся с высокой степенью согласования в рамках модели с двумя пулами везикул и одним типом эндоцитоза.

Исследование воздействия теплового шока и экранирования электромагнитного поля на локомоторное поведение личинок Drosophila melanogaster Захаров Геннадий Александрович (Санкт-Петербург, gennadiy.zakharov@gmail.com) Согласно современным данным, экранирование человека от магнитного поля Земли (что иногда необходимо при эксплуатации промышленного и военного оборудования) приводит к стрессу, агрессии, нарушениям поведения и нейропатологии. Для изучения этого явления требуется привлечение модельных объектов, например дрозофилы, белки нервной системы которой обладают высокой степенью гомологии с человеческими (Fortini et al., 2000). Важную роль в возникновении нейродегенеративных расстройств, играют нарушения механизмов организации цитоскелета (Ramaekers, Bosman, 2004), в частности сигнального каскада ремоделирования актина и его ключевого фермента LIMK1 (Weeber et al., 2002).

О развитии нейродегенерации можно судить по локомоторному поведению, поскольку оно вовлечено во все виды поведенческой активности (Martin, 2004).

Целью данной работы являлось исследование влияния экранирования магнитного поля на локомоторное поведение личинок дрозофилы в сравнении с воздействием тепловым шоком (ТШ). Для исследования роли LIMK1 использовалась мутантная линия agnts3, несущая нарушения гена LIMK1 и отличающаяся существенными нарушениями обучения и памяти (Savvateeva-Popova, 2002).

Показано, что тепловой шок угнетает локомоторную активность личинок дикого типа CS, и стимулирует активность agnts3. На western-блоте наблюдается существенное увеличение концентрации HSP70 и LIMK1 у CS, и падение уровня LIMK у agnts3. При нахождении в ослабленном магнитном поле в течение 12 часов наблюдается резкое увеличение всех параметров локомоторной активности у исследованных линий, при этом концентрация HSP70 и LIMK1 заметно падает. У agnts3 происходит восстановление дефектов пространственного ориентирования. Действие ослабленного магнитного поля в течении одного часа у CS приводит к незначительному возрастанию подвижности, в то время как у agnts3 оно приближается по силе к 12-часовому.

Полученные результаты указывают на участие системы ремоделирования актина в развитии ответа на магнитное поле, а также на существенное различие в механизмах ответа на действие ТШ и магнитного поля, возможно связанное с активацией каскада HSP.

Автор выражает признательность Б.Ф. Щеголеву, Т.В. Паялиной и Е.В. СаваатеевойПоповой за помощь в подготовке и проведении работы, а также за ценные замечания.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект 07-04-00655), гранта СПб НЦ (Е.В. Савватеевой-Поповой), Программы Президиума РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов».

Система направленной визуализации глиом на основе наночастиц оксида железа Зоркина Яна Александровна (Москва, viverina@gmail.com) Наночастицы железа и его оксидов, в частности гамма оксида железа (III) (-Fe2O3), за последние десять лет привлекают всё больше внимания исследователей со всего мира.

Такие свойства, как суперпарамагнетизм, низкая токсичность и малый размер и доступность для конъюгации с векторным молекулами для ткань-специфической доставки делают возможным их применение для визуализации методом магнитной резонансной томографии различных типов опухолей, в том числе и глиобластомы головного мозга человека.

Для создания подобной конструкции в нашей лаборатории методом термического разложения пентакарбонила железа (Fe(CO)5) были синтезированы суперпарамагнитные наночастицы -Fe2O3, покрытые защитной оболочкой из олеиновой кислоты и дистеароилфосфоэтаноламин полиэтиленгликоля (DSPE-PEG). Также наночастицы были помечены флуоресцентным маркёром DILC18. По результатам просвечивающей электронной микроскопии размер металлического ядра составил 3,5±0,5нм, а гидродинамический радиус, измеренный методом динамического светорассеяния, составил 140±40нм. Исследования, проведённые с помощью флуоресцентной микроскопии на клетках глиомы человека С6 и фибробластов крысы показали, что наночастицы способны к адгезии на поверхности этих клеток. Таким образом в результате нашей работы были получены наночастицы -Fe2O3 с известным радиусом, устойчивые к агрегации в водной среде и была обнаружена адгезия полученных частиц на клетках глиомы.

Влияние внутрибрюшных инъекций фуллеренов на функциональные способности эритроцитов крыс Камалетдинова Татьяна Рашидовна (Москва, kamaletdinovat@gmail.com) Широкое использование наноматериалов в последние годы вызывает интерес с точки зрения их влияния на различные клетки и ткани организма, а так же здоровье в целом.

Проведенные ранее исследования предполагают цитотоксическое и генотоксическое воздействие растворов фуллеренов на различные типы клеток, такие как человеческие фибробласты кожи, клетки зародышевой почки человека, яйцеклетки китайских хомячков и ряд других, что связанно с их способностью генерировать активные формы кислорода и, тем самым, вызывать перекисное окисление липидов. По другим данным фуллерены могут использоваться как противовирусные вещества.

В данном исследовании изучались биологические эффекты, оказываемые фуллеренами, вводимыми в различных концентрациях, на количество оксигемоглобина в крови крыс.

Животные так же подвергались физической нагрузке – проводились тесты на изнуряющее плавание, что увеличивало гипоксический эффект, тем самым позволяя более точно оценить влияние фуллеренов на количество оксигемоглобина в крови. Наблюдение велось в течение 4-х дней.

Исследование состояния гемоглобина проводили с помощью метода КР на цельной крови.

Гемопорфирин обладает интенсивным сигналом КР, очень чувствителен к появлению дополнительного (шестого) лиганда, что позволяет достаточно точно оценивать количество гемоглобина в окисленной и восстановленной формах. Увеличение/уменьшение оксигемоглобина в крови может свидетельствовать об увеличении способности гемоглобина связывать кислород, либо об уменьшении способности его выделять. Изменения сродства гемопрофирина к кислороду вероятно связаны с изменением расстояния между атомом железа и кольцом гемопорфирина, что можно зарегистрировать с помощью данного метода.

С использованием КР спектроскопии были выявлены различия в количестве оксигемоглобина в крови контрольных и подверженных действию фуллеренов животных.

Изучение функционирования калиевого канала KcsA бактерии Streptomyces lividans методами молекулярного моделирования Касимова Марина Анатольевна (Москва, skyfalls@mail.ru) Ионные каналы – это биологические наноструктуры, входящие в состав белкового компонента клеточной мембраны. Их основной функцией является селективный контроль ионной проводимости. В связи с этим ионные каналы оказываются вовлечены в целый спектр важнейших физиологических процессов, таких как генерация электрической активности в нервных и мышечных клетках, контроль возбудимости сердечной мышцы, внутриклеточная передача сигнала, секреция гормонов (инсулин), клеточная пролиферация и регуляция клеточного объема. Неправильная работа ионных каналов может служить причиной различных патологий. Эпилепсия, эпизодическая атаксия (временное расстройство координации движений), длинный QT синдром, синдром Барттера (Bartter), пузырчатый фиброз, сердечная аритмия и один из типов диабетов являются следствием дисфункции этих биологических наноструктур. Последнее указывает на актуальность изучения структуры и функционирования ионных каналов с целью последующего применения полученных знаний для разработки направленных лекарств.

Исследование ионных каналов может основываться на использовании молекулярнобиологических методов, позволяющих определять в основном структуру белка, и электрофизиологических методов, направленных на изучение принципов функционирования данных биологических объектов. Однако детальное представление механизмов работы ионного канала на молекулярном уровне возможно с применением другого подхода – молекулярной динамики биологических объектов.

В качестве объекта исследования был выбран бактериальный калиевый канал KcsA, обладающий целым рядом сходств с потенциал-зависимыми калиевыми каналами возбудимых клеток эукариот. Для произведения расчетов использовался программный пакет AMBER10 (http://ambermd.org/). На начальном этапе работы проводили построение структуры канала в открытой конформации: с помощью метода управляемой молекулярной динамики внутренние спирали KcsA раздвигали до заданных координат. Правдоподобность полученной модели оценивали, во--первых, сравнивая диаметр поры канала в области внутриклеточных ворот с размером молекулы тетраэтиламмония (блокатор), во-вторых, рассчитывали значение ионной проводимости по алгоритму программы hole (http://d2o.bioch.ox.ac.uk:38080/).

На следующем этапе работы полученную структуру KcsA встраивали в систему, состоящую из октана и воды – компонентов, имитирующих соответственно гидрофобную и гидрофильную фазы. Изучение проводимости бактериального канала проводили методами равновесной и управляемой молекулярной динамики.

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 85 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.