WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 55 | 56 || 58 | 59 |   ...   | 85 |

Показано, что ренатурация и олигомеризация GroES происходит спонтанно и эффективно без каких-либо дополнительных факторов или лигандов. Ренатурация GroEL до мономерной формы так же не нуждается в дополнительных факторах, в то время как для олигомеризации GroEL требуется присутствие Mg2+ и АТФ. Также обнаружено, что при небольших концентрациях мономерной формы GroEL (менее 0,1 мг/мл) MgАТФ-индуцируемая сборка олигомерной структуры GroEL происходит только в присутствии его ко-шаперона GroES.

При более высоких концентрациях мономерной формы GroEL для сборки олигомерной GroEL-частицы присутствие GroES не обязательно, но оно значительно ускоряет процесс самоорганизации шаперонной системы.

Исследована зависимость скорости сборки олигомерной частицы GroEL, индуцируемой присутствием MgАТФ, от молярного избытка GroES. Показано, что скорость более быстрой фазы в кинетике олигомеризации GroEL зависит от молярного избытка GroES, а вторая более медленная не зависит, что позволяет предположить наличие взаимодействия GroES с кинетическим олигомерным интермедиатом. Процесс сборки GroEL-частицы был исследован также с помощью кругового дихроизма в присутствии Mg2+ и 20% глицерина.

Показано, что окончательное формирование вторичной структуры GroEL происходит в две стадии, первая из которых предположительно отражает формирование элемента вторичной структуры, ответственного за специфические межмолекулярные взаимодействия, а вторая – доворачивание вторичной структуры в составе олигомера. По результатам исследований была предложена модель сборки шаперонной системы GroES/GroEL in vitro.

Работа поддержана программами «Молекулярная и клеточная биология», ФЦП №02.740.11.0295, ФЦП № П304 и грантами «Научная школа» (НШ-2791.2008.4), РФФИ (09-04-00768-а) и HHMI – 55005607. Выражаю благодарность научному руководителю Семисотнову Г.В., а также Марченкову В.В., Котовой Н.В. и всем сотрудникам лаборатории физики белка.

Влияние метилирования гена sdh 1-2 сукцинатдегидрогеназы на уровень его экспрессии при прорастании семян Zea mays L.

Селиванова Н.В., Федорин Д.Н., Гончаренко И.Н. (Воронеж, kir2202@yandex.ru) Метилирование ДНК играет важную роль в модуляции структуры хроматина, регуляции транскрипции и стабильности генома. У растений степень метилирования CG-динуклеотидов, входящих в состав промоторной части генов сильно изменяется при прорастании семян, при переходе к цветению и после заражения грибами и вирусами.

В связи с этим целью данной работы явилось изучение влияния степени метилирования гена sdh1-2 субъединицы А сукцинатдегидрогеназы (СДГ, КФ 1.3.99.1) на уровень его экспрессии при прорастании семян кукурузы. В качестве объектов исследования использовали кукурузу Zea mays L.

Исследование уровня экспрессии гена sdh1-2 в щитках кукурузы показало, что интенсивность его транскрипции в течение всего периода развития неодинакова.

Установлено, что при прорастании семян происходит изменение уровня экспрессии гена sdh1-2 СДГ: с первого по пятый день прорастания он активно транскрибируется, достигая максимума на четвертый день экспозиции. Однако уже на 7-е сутки количество транскрипта гена sdh1-2 снижалось на 37% от максимального значения, стабилизируясь в дальнейшем на том же уровне. В ходе анализа промотора гена sdh1-2 СДГ выявили наличие одного CpG-островка размером 140 п.н. (в положении с -617 до -756 н.). Степень метилирования определяли у трех CG-динуклеотидов в положении -631, -583 и -912. Результаты метилспецифичной полимеразной цепной реакции показали, что степень метилирования отдельных CG-динуклеотидов в составе промотора гена sdh1-2 изменяется в течение прорастания семян кукурузы. В первые дни экспозиции все исследуемые CG-динуклеотиды были неметилированы. Однако, начиная с шестого дня прорастания наблюдалось частичное метилирование цитозина в положениях -631 и -912, что может быть одним из механизмов регуляции скорости экспрессии исследуемого гена в данный период. Полученные данные о характере метилирования промотора исследуемого гена коррелируют с изменением количественных показателей транскрипта гена sdh1-2 сукцинатдегидрогеназы при прорастании семян кукурузы. При этом увеличение степени метилирования CG-динуклеотидов в промоторе исследуемого гена проявляется в снижение скорости его транскрипции.

Таким образом, установлено снижение скорости транскрипции гена sdh1-2 субъединицы А СДГ при прорастании семян и смене типа питания растительной клетки с гетеротрофоного на автотрофный. Механизм ингибирования транскрипции следуемого гена на начальном этапе онтогенеза кукурузы обусловлен, в частности, изменением степени метилирования CG-динуклеотидов в составе его промотора.

Анализ энхансер-подобного элемента, расположенного во втором интроне гена U2AF1LCмирнов Николай Андреевич (Москва, smirnov.kolek@gmail.com) Одними из ключевых регуляторов транскрипции эукариот являются энхансеры, которые представляют собой класс цис-регуляторных элементов, активирующих транскрипцию генов. Располагаться энхансеры могут как в межгенных участках, так и внутри генов. Для ряда клеточных энхансеров характерным является то, что их активность сосредоточена в коротком фрагменте 20-30 п.н., названном коровым элементом. Как правило, коровый элемент содержит один или несколько сайтов связывания транскрипционных факторов, которые определяют особенности функционирования энхансера.

Среди исследованных энхансеров не обнаруживается четкой гомологии в последовательностях ДНК. Однако информация о нуклеотидных последовательностях геномов различных организмов, как близкородственных, так и далеко отстоящих друг от друга в эволюционном ряду, позволяет использовать методы сравнительной геномики для идентификации функциональных областей генома, а также позволяет в некоторых случаях выявить коровые участки внутри уже известных цис-регуляторных областей генома.

Ранее в нашей лаборатории внутри локуса 19q13.12 хромосомы 19 человека был идентифицирован ряд последовательностей, обладающих активностью энхансеров в клетках HeLa. В этой работе мы провели поиск кор-последовательности, отвечающей за энхансерную активность одного из обнаруженных энхансер-подобных элементов (энхансер №12), расположенного во втором интроне гена U2AF1L4.

Нами были определены гомологичные энхансеру №12 последовательности в геномах 7 видов приматов. С помощью метода сдвига электрофоретической подвижности в геле мы показали, что обнаруженные последовательности приматов конкурируют in vitro с последовательностью энхансера №12 за связывание с ядерными белками.

Мы предположили, что за взаимодействие ядерных белков с энхансером ответственны наиболее консервативные участки нуклеотидной последовательности. С помощью сравнительного анализа гомологичных последовательностей мы выделили пять консервативных участков (CNS 1-5) внутри исследуемого элемента.

Делеционный анализ энхансера №12 с использованием системы двойной люциферазной детекции показал, что его центральная область, содержащая консервативный участок CNSдлиной 22 п.н., существенна для функционирования энхансера. Консервативный участок CNS4 содержит мотив CCCTCC, который представляет гипотетический сайт связывания белков Sp-семейства, в частности, распространенного активатора транскрипции Sp1.

С помощью метода сдвига электрофоретической подвижности в геле мы показали что, CNSспецифически взаимодействует с ядерными белками клеток HeLa, распознающими Sp1-консенсус (GC-бокс).

Разработка методики выделения регуляторных клеточных белков фосфатазы PP1, участвующих в репликации вируса иммунодефицита человека Темкина О.А., Клотченко С.А., Шалджян А.А. (Санкт-Петербург, o-temkina@yandex.ru) CDK9/циклин T1 – это протеинкиназа, которая фосфорилирует С-концевой домен большой субъединицы РНК полимеразы II (RNAPII). Ранее in vitro было показано, что автофосфорилирование CDK9 на С-конце играет важную роль для эффективного связывания CDK9/циклин T1 с TAR РНК и Tat вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). При этом в дефосфорилировании CDK9 в культивируемых клетках участвует протеинфосфотаза-(PP-1) и, таким образом, вносит вклад в активацию транскрипции ВИЧ-1 белком Tat. Наши предыдущие исследования показали, что РР1 стимулирует Tat-зависимую транскрипцию ВИЧ-1 как in vitro, так и в культивируемых клетках. Tat содержит РР1-связывающий мотив и, таким образом, может функционировать как РР1 регуляторная субъединица.

При транскрипции ВИЧ-1 РР1 может привлекаться к RNAPII белком Tat ВИЧ-1, который может выступать в роли специфической CDK9 направленной субъединицы.

Наше исследование нацелено на определение регуляторных клеточных субъединиц, которые направляют РР1 к RNAPII и/или CDK9, с использованием протеомного подхода.

Клеточный экстракт, приготовленный из 293Т клеток, был фракционирован на линейном градиенте глицерина от 10% до 30% в буфере, содержащем 20 mM HEPES-KOH, pH 7,9, mM KCl, 200 мкМ EDTA. На градиент наносили по 1 мл лизата и центрифугировали на ультрацентрифуге “Beckman L8-60M” (ротор SW 41Ti) при 38000 об/мин 20 часов при +4°С.

После центрифугирования фракции собирали по 500 мкл, всего отобрали 21 фракцию. Далее из полученных фракций переосаждали белки и проводили дальнейший анализ методом иммуноблотинга с антителами к РР1 и RNAPII. Для дальнейшего анализа отбирали только фракции, в которых выявляли РР1 и/или RNAPII. Далее для очистки РР1 и RNAPII, а также комплексов, ассоциированных с ними белков, использовали 2 типа аффинных колонок, содержащих сефарозу, конъюгированную с микроцистином, который позволяет высокоспецифично связываться с PP1, и моноклональными антителами к РНКполимеразе II. После хроматографического разделения фракции разделяли методом двумерного электрофореза. Полученные зоны в дальнейшем будут использованы для проведения масс-спектрометрического анализа.

Разработка векторных систем для сайт-специфической интеграции и стабилизации трансгенов Ткачук Артем Петрович (Москва, artem.p.tkachuk@gmail.com) Важной проблемой при создании трансгенных организмов является стабилизация трансгенов после их интеграции в геном (Hoy, 2000). Для получения трансгенных насекомых используют неавтономные транспозоны. При этом трансген остается окружён функциональными инвертированными повторами. При каком-либо внешнем источнике транспозазы, например, вследствие заражения вирусом, трансген способен к ремобилизации, что потенциально опасно. Для стабилизации трансгена после его интеграции необходимо удалить одно из плечей транспозона, с помощью которого произошла встройка. Существуют разные подходы к решению этой задачи, однако универсального, простого и эффективного способа до сих пор не найдено (Handler et al., 2004).

Известно, что репарация двуцепочечных разрывов ДНК иногда приводит к потере небольшого участка генома. Это чаще всего происходит вследствие того, что разрыв произошел между двумя сонаправленными гомологичными участками хромосомы. В таком случае активируется консервативный SSA путь репарации разрывов, который и приводит к потере дистального участка гомологии (Kappeler et al., 2008). Мы использовали этот принцип для создания вектора, позволяющего не только сайт-специфически ввести в геном реципиента интересующую нас последовательность (с помощью интегразы phiC31), но и стабилизировать её.

В составе разработанного вектора трансген окружен последовательностями, гомологичными соответствующим последовательностям геномного локуса, куда произошла интеграция. Участки гомологии фланкируют уникальные сайты узнавания хомингэндонуклеаз рестрикции I-Sce I с 3’ конца и I-Cre I с 5’ конца. За ними расположены гены маркёрных белков (красный флуоресцентный белок – RFP с 5’ конца и ген white, отвечающий за красную окраску глаз насекомого – на 3’ конце) и плечи транспозона, с помощью которого происходит интеграция конструкции в геном реципиента. Внесение двуцепочечных разрывов (в результате введения хоминг-рестриктазы путем скрещивания с насекомым – носителем гена I-Sce I и I-Cre I) инициирует репарацию по SSA пути, в результате которой происходит потеря плечей транспозона, генов маркёрных белков и одной из гомологичных последовательностей. В результате трансген остается интегрирован непосредственно в геномный контекст. Эффективность SSA репарации в нашей системе достигает 70% (у существующих методов – 2%). Наличие удаляемых маркеров позволяет легко детектировать продукты репарации. Векторная система была протестирована на Drosophila melanogaster.

Изучение биологических свойств и терапевтического потенциала ФНО-связывающих белков поксвирусов Трегубчак Татьяна Владимировна (Новосибирск, treg-@mail.ru) В геноме представителей рода Ortopoxviridae закодировано множество иммуномодуляторов, функция которых заключается в обеспечении эффективного уклонения от защитных реакций поражаемого организма. Одними из таких иммуномодуляторов являются Crm-белки (cytokine response modifier). В геноме вируса натуральной оспы (ВНО) представлен только один белок данного семейства – это белок CrmB, эффективно связывающий фактор некроза опухолей (ФНО) и хемокины. Как эффективный антагонист ФНО, данный белок может быть рассмотрен в качестве основы для создания ФНО-блокаторов, направленных на лечении заболеваний, связанных с гиперпродукцией ФНО (болезнь Крона, ревматоидный артрит и др). Наиболее перспективными в вопросе выбора основы для создания терапевтического средства, по-видимому, являются иммуномодулирующие белки ВНО, эволюционно наиболее адаптированного к защитным системам человеческого организма.

Ранее для белка CrmB ВНО на мышиной модели ЛПС-индуцированного эндотоксического шока был показан значительный терапевтический эффект, поэтому следующим этапом исследования CrmB ВНО в качестве лекарственного средства было определение иммуногенности данного белка. Нами впервые была определена иммуногенность рекомбинантного белка CrmB ВНО относительно белка оболочки поксвирусов A30L ВНО. Исследования сывороток, полученных после иммунизации мышей, методами ИФА и Вестерн-блот анализа показали, что белок CrmB ВНО активирует гуморальный иммунный ответ, столь же эффективно, как и белок A30L, эмульгированный в адъюванте Фрейнда. Таким образом для белка СrmB ВНО была показана высокая иммуногенность.

Pages:     | 1 |   ...   | 55 | 56 || 58 | 59 |   ...   | 85 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.