WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 54 | 55 || 57 | 58 |   ...   | 85 |

Для детекции межклеточного транспорта РНК ХВК мы решили использовать подход, основанный на способности белка оболочки бактериофага MS2 (БОMS2) с высокой специфичностью связываться с уникальной 19 нуклеотидной последовательностью (MS2 шпилька) геномной РНК фага. В состав исследуемой РНК встраивается последовательность MS2 шпильки. Слитый с зеленым флуоресцентным белком БО MSсвязывается с MS2 шпилькой, что позволяет детектировать локализацию исследуемой РНК в интактной клетке. Таким образом, целью данной работы было создание вирусного вектора на основе кДНК копии геномной РНК Х вируса картофеля, содержащего последовательность MS2 шпильки и ген красного флуоресцентного белка (RFP). Мы, предполагаем, что наличие MS2 шпильки в составе вирусной РНК позволит детектировать её переход в соседнюю незараженную клетку, с помощью описанного выше подхода.

А последующая экспрессия красного флуоресцентного белка в этой клетке – трансляционнную активацию вирионной РНК.

Исходя из анализа функциональной значимости различных участков геномной РНК вируса, нами были выбраны области для встраивания гена RFP и MS2 шпильки.

Для проверки влияния MS2 шпильки на экспрессию окружающих ее генов, в клетках листа Nicotiana benthamiana была экспрессирована мРНК, в которой после открытой рамки считывания RFP была встроена последовательность MS2 шпильки. Было показано, что MSшпилька не блокирует экспрессию RFP.

Таким образом, исходя из полученных результатов, была определена область вирусной РНК предположительно подходящая для встраивания гена RFP и MS2 шпильки. Далее, нами был получен вирусный вектор на основе кДНК копии геномной РНК ХВК, содержащий ген RFP под контролем дуплицированного субгеномного промотора БО и последовательность MS2 шпильки.

Целью дальнейшей работы будет определение возможности использования полученной системы для детекции межклеточного транспорта и трансляционной активации инкапсидированной РНК ХВК in vivo.

Использование метода FRAP для изучения эффективности действия специфичных к мРНК белка eGFP антисмысловых олигонуклеотидов различной вторичной структуры Молчанова Е.С., Кошелева Н.В. (Москва, alena.molchanova@gmail.com) Открытиями последних десятилетий в области генетики и молекулярной биологии показана возможность модуляции экспрессии генов антисмысловыми олигонуклеотидами (АсОДН), направленными на матричные РНК и ингибирующими трансляцию.

Целью исследования стала разработка способа полуколичественной оценки экспрессии флуоресцентного белка eGFP в живой клетке и изучение с применением этой методики эффективности воздействия АсОДН на экспрессию этого белка в клетках eGFP+ мышей в зависимости от вторичной структуры олигонуклеотидов.

На основе метода FRAP (восстановление интенсивности флуоресценции после фотоотбеливания) мы разработали способ, позволяющий оценить изменение количества белка-мишени eGFP по изменению интенсивности его флуоресценции. Работа выполнена на культуре дермальных фибробластов мышей линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb/J).

Различия интенсивности флуоресценции eGFP оценивали по степени восстановления интенсивности флуоресценции в ядрах клеток, подвергшихся фотоотбеливанию. В циклах FRAP характер восстановления флуоресценции у соседних клеток одного образца зависел от уровня интенсивности флуоресценции до начала фотоотбеливания. Кривые изменения интенсивности флуоресценции аппроксимировали квадратичной функцией, на полученном графике находили точку, производная в которой равна нулю (точка выхода на плато), рассчитывали разницу в интенсивности флуоресценции в точке начала восстановления флуоресценции и в точке выхода на плато. Данная величина прямо пропорционально зависела от интенсивности флуоресценции до начала фотоотбеливания. Рассчитываемая разница интенсивности флуоресценции белка-мишени в циклах FRAP позволила полуколичественно оценить уровень белка eGFP в клетках.

С применением разработанного метода полуколичественной оценки уровня экспрессии белка на основе метода FRAP исследовали эффективность действия специфичных к мРНК egfp АсОДН, имеющих линейную вторичную структуру, и АсОДН, формирующих вторичную структуру «шпилька». Дермальные фибробласты GFP+ мышей культивировали в стандартных условиях, ежедневно добавляли олигонуклеотиды в экспериментальные группы и на восьмой день оценивали эффективность действия АсОДН. Линейный АсОДН практически не влиял на экспрессию белка eGFP: в циклах FRAP разности в интенсивности флуоресценции в точке начала восстановления флуоресценции и в точке выхода на плато в контрольном образце и в образце после инкубации с линейным АсОДН были сходны и напрямую зависели от интенсивности флуоресценции до начала фотоотбеливания. После инкубации с АсОДН «шпилькой» белка eGFP в клетках стало настолько мало, что его количество после фотоотбеливания не восстанавливалось (рассчитываемая в циклах FRAP разность была отрицательна). Снижение уровня экспрессии белка eGFP после воздействия АсОДН «шпилька» было подтверждено с помощью вестерн-блота.

Исследования выполнены в рамках Программы поддержки научно-исследовательской работы молодых ученых ВУЗов России компании Сarl Zeiss, Германия (грант №2-13).

Изучение структуры и свойств вирусных частиц, собранных из белка оболочки фитовируса и гетерологичных РНК Петрова Екатерина Кирилловна (Москва, katerina519@mail.ru) Важной стадией в жизненном цикле вируса является упаковка вирусного генетического материала в вирион. Многие вирусы можно реконструировать in vitro из вирусной РНК и белка оболочки (БО), однако эффективность сборки in vitro и in vivo сильно различается.

Очевидно, что в упаковке вирусного генома участвуют не только вирусные компоненты, но и компоненты клетки-хозяина.

Целью работы является изучение структуры, свойств и условий сборки вирусных частиц, собранных из БО фитовируса и гетерологичных РНК in vitro.

Исследована гомологичная и гетерологичная сборка БО Х-вируса картофеля (ХВК) с РНК вирусов, относящихся к различным таксономическим группам вирусов растений и к вирусам животных. Для этого были использованы гомологичная РНК (РНК ХВК) и гетерологичные (чужеродные) РНК: вируса мозаики нарцисса (ВМН), вируса аукубы мозаики картофеля (ВАМК), вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт), вируса табачной мозаики (ВТМ), вируса мозаики костра безостого (ВМК) – тотального препарата и отдельно трех геномных и субгеномной РНК, вируса Менго (вирус животных). Показана возможность сборки «гибридных» вирусных частиц, состоящих из БО ХВК и гетерологичных РНК. С помощью электронной (ЭМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ) впервые показано, что по своей структуре вирусные рибонуклеопротеиды (вРНП) с гетерологичной РНК идентичны вРНП с гомологичной РНК (БО ХВК – РНК ХВК). Эффективность сборки вРНП, содержащих гетерологичные РНК, сопоставима с гомологичной сборкой. Размеры гетерологичных частиц соответствуют размерам гомологичных частиц. Ранее в нашей лаборатории было продемонстрировано, что РНК ХВК в составе вРНП (БО ХВК – РНК ХВК) не доступна для рибосом, но начинает транслироваться при взаимодействии с транспортным белком 1 (ТБ1).

Показано, что гетерологичная нуклеиновая кислота недоступна для рибосом в составе собранных вРНП. Получены экспериментальные данные о трансляционной активации гетерологичных нуклеиновых кислот в составе этих частиц при добавлении к ним ТБ1 ХВК.

Можно сделать вывод, что сборка in vitro, по-видимому, не является нуклеотидспецифичной, то есть она не зависит от нуклеотидной последовательности 5’-конца РНК.

На следующем этапе была проверена возможность сборки БО ХВК с субгеномной (4-й) РНК ВМК, выделенной из тотального препарата, и фрагмента, полностью соответствующего по нуклеотидной последовательности 4-й РНК, полученного при разрезании 3-й геномной РНК ВМК в присутствии олиго-d(T) РНКазой Н (SH-фрагмент). SH-фрагмент отличался от РНК4 только отсутствием кэп-структуры. Оказалось, что РНК4 ВМК образует вРНП, как и другие гетерологичные РНК. При инкубации БО ХВК с SH-фрагментом образование вРНП зафиксировать не удалось.

Изучен возможный вклад кэп-структуры при сборке вРНП in vitro на примере природных РНК, а также кэпированных и некэпированных транскриптов 5’-концевой области РНК ХВК.

Изучение экспрессии гена сладкого белка тауматина II из Thaumatococcus daniellii в трансгенных растениях табака Пушин Александр Сергеевич (Пущино, aspushin@rambler.ru) Сверх сладкий белок тауматин II впервые выделен из плодов западноафриканского растения Thaumatococcus daniellii Benth. Сравнение аминокислотной последовательности тауматина, определенной по кДНК, с аминокислотной последовательностью, определенной секвенированием белка, показало, что тауматин синтезируется в виде предшественника (препротауматина), который содержит N-концевой гидрофобный сигнальный пептид, состоящий из 22 а.к. остатков и C-концевой пептид, состоящий из 6 а.к. остатков.

Целью наших исследований было изучить влияние удаления N- и C-сигнальных последовательностей препротауматина на характер экспрессии тауматина в трансгенных растениях табака. Для этого были синтезированы несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующие разные формы тауматина: форму с удаленным С-концевым сигнальным пептидом; форму с удаленными N- и С-сигнальными пептидами;

форму с удаленным N-концевым сигнальным пептидом. В качестве контроля использовали ген, кодирующий препротауматин – форму, содержащую оба сигнальных пептида.

Все нуклеотидные последовательности клонировали в бинарный вектор pBI121 вместо гена uidA, под контроль промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и терминатора гена нопалинсинтазы. Полученные векторы переносили в супервирулентный обезоруженный агробактериальный штамм CBE21, который использовали для трансформации растений табака сорта Petite Havana SR. Отобранные трансгенные линии табака использовали для анализа. Анализ экспрессии гена тауматина при помощи иммуноблотинга с применением поликлональных антител, специфичных к тауматину, показал следующие результаты.

При наличии N- и С-сигнальных последовательностей тауматин накапливался внутриклеточно (предположительно в вакуолях) и соответствовал по подвижности зрелому белку, что свидетельствует о прохождении процессинга. Удаление С-концевого гексапептида, привело к секреции тауматина в межклеточное пространство, при этом процессинг проходил корректно. Иммуноферментный анализ показал, что удаление обоих сигнальных пептидов или только N-концевого снизило уровень накопления тауматина в трансгенных растениях табака.

Изучение участия 5-UTR CUP1 S. cerevisiae в HSP104 опосредованной регуляции экспрессии генов Рубель А.А., Игнатова В.В. (Санкт-Петербург, arubel@mail.ru) В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что белки в клетке не ограничиваются выполнением одной функции. Было показано, что многие шапероны участвуют в различных клеточных процессах, в том числе участвуют в регуляции экспрессии генов. Такие данные получены для дрожжевого шаперона Zuotin (семейство Hsp40/DnaJ) и для представителей семейства Hsp100/ClpB – растительного Hsp101 и дрожжевого Hsp104, которые являются ортологами. Показано, что эти шапероны могут участвовать в регуляции экспрессии за счет связывания с UTR мРНК определенных генов. Нами показано, что независимо от уровня транскрипции, экспрессия генов, находящихся под контролем промотора гена CUPпозитивно регулируется шапероном Hsp104. В геноме Saccharomyces сerevisiae присутствуют две копии этого гена. CUP1-1и CUP1-2 имеют абсолютно идентичные промоторные области и кодируют белки металлотионеины, детоксифицирующие ионы меди и кадмия, что может свидетельствовать о том, что Hsp104 участвует в дополнительной тонкой регуляции ответа клетки на стресс, вызванный их действием. Возможно также, что роль Hsp104 не ограничивается только стрессовым ответом на ионы двухвалентных металлов, а является частью HSF-зависимого каскада реакции клетки на разные виды стресса.

Мы исследовали роль 5’-UTR мРНК CUP1 в регуляции экспрессии на посттранскрипционном уровне при участии шаперона Hsp104 у дрожжей S. сerevisiae.

Был проведен in silico анализ вторичных структур, которые могут формировать два альтернативных варианта 5’-UTR CUP1 и находящихся в этих последовательностях сайтов потенциального связывания факторов транскрипции и трансляции. Было установлено, что 5’-UTR мРНК CUP1 содержит четыре тандемных повтора (CAAU). С помощью флуоресцентной микроскопии и Вестерн-блот гибридизации, мы показали, что делеция или мутагенез этих повторов приводят к отсутствию продукции репортерных белков.

Для изучения влияния 5’-UTR CUP1, мы сконструировали плазмиды, несущие репортерный ген GFP, под разными промоторами с неизмененными лидирующими участками и с дополнительными последовательностями 5’-UTR мРНК CUP1 перед стартовым кодоном.

Мы использовали метод ОТ-ПЦР РВ для разграничения изменений, происходящих при введении в конструкцию дополнительного 5’-UTR, на уровне транскрипции и на уровне трансляции. Уровень продукции репортерных белков был исследован в штаммах с нормальным уровнем продукции Hsp104, сверхпродукции Hsp104 и в изогенном штамме с делецией гена hsp104. Нами установлено, что введение дополнительной последовательности 5’-UTR мРНК CUP1 приводит к позитивной регуляции экспрессии репортерного гена вне зависимости от промотора. Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы.

Модель сборки шаперонной системы GroEL/GroES клеток E.coli in vitro:

равновесные и кинетические исследования процессов самоорганизации шаперона GroEL и ко-шаперона GroES Рябова Наталья Александровна (Пущино, ryabova@phys.protres.ru) Шаперонная система клеток Escherichia coli, представленная двумя олигомерными белками – шапероном GroEL (850 кДа) и ко-шапероном GroES (70 кДа), участвует в сворачивании многих клеточных белков, взаимодействуя с их ненативными конформационными состояниями и предотвращая их неспецифическую агрегацию.

Вместе с тем, процесс сворачивания самих шаперонов изучен недостаточно, хотя это важно для понимания общего механизма самоорганизации сложных олигомерных белков.

В настоящей работе исследована сборка in vitro олигомерной частицы GroEL, состоящей из 14-ти субъединиц с молекулярным весом 57 кДа каждая и олигомерного ко-шаперона GroES, состоящего из 7-ми субъединиц с молекулярным весом по 10 кДа каждая.

Pages:     | 1 |   ...   | 54 | 55 || 57 | 58 |   ...   | 85 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.