WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 53 | 54 || 56 | 57 |   ...   | 85 |

При персистировании в лёгких резистентной мыши наблюдается повышенная экспрессия генов, отвечающих за изменение свойств клеточной поверхности, переход к анаэробному нитратному дыханию, деградацию жирных кислот, биосинтез микобактина – поликетида, отвечающего за восполнение недостатка железа. В M. avium, персистирующей в лёгких мыши устойчивой линии, повышена экспрессия генов, отвечающих за осуществление цикла Кребса и окислительное фосфорилирование, биосинтез жирных кислот, репликацию и трансляцию, а также инактивацию NO, выделяемого макрофагами. В результате исследования получены профили транскрипции всех генов M. avium при инфицировании мышей устойчивой и восприимчивой линий. На основании этих данных определены изменения метаболизма M. avium, свидетельствующие о том, что в организме мыши устойчивой линии наблюдается переход микроорганизма к латентному состоянию, вызванный дефицитом ионов дивалентных металлов.

Работа выполнена под руководством д.б.н. Ажикиной Татьяны Леодоровны.

Влияние 5-прилегающих последовательностей на транскрипцию РНК-полимеразой III гена 4,5SН РНК в системе in vitro и в живой клетке Коваль Анастасия Павловна (Москва, panikoval@yandex.ru) 4,5SН РНК – это малая РНК длиной 94 нуклеотида, синтезируемая РНК-полимеразой III.

4,5SН РНК распространена только среди представителей 6 семейств из отряда грызунов и ее последовательность имеет значительную гомологию с 7SL РНК-родственными ретропозонами грызунов (В1-элемент) и приматов (Alu-элемент). Функции данной РНК остаются неизвестными, хотя показано, что 4,5SН РНК ассоциирована с поли(А)содержащими молекулами РНК в живой клетке и взаимодействует с девятью различными клеточными белками in vitro.

Гены 4,5SH РНК содержат внутренний промотор РНК-полимеразы III, состоящий из боксов А и В. Долгое время считалось, что при наличии данного типа промотора последовательности, окружающие ген, не оказывают значимого воздействия на транскрипцию РНК-полимеразой III. Однако оказалось, что это не так. В ряде работ было показано, что 5'-прилегающие последовательности могут изменять эффективность транскрипции различных генов РНК-полимеразы III.

Целью представленной работы было определение роли последовательностей, прилегающих к гену 4,5SН РНК, в его транскрипции. Нами обнаружено, что для гена 4,5SH РНК влияние 5'-прилегающих последовательностей на эффективность транскрипции может быть исключительно сильным: различные последовательности могут как полностью репрессировать транскрипцию, так и обеспечивать ее высокую эффективность. В свою очередь, укорочение геномной 5'-прилегающей к гену 4,5SH РНК мыши последовательности приводит к активации дополнительной точки старта транскрипции, расположенной перед началом гена. Таким образом, 5'-прилегающие к гену 4,5SH РНК последовательности играют большую роль, как определяя эффективность транскрипции, так и принимая участие в точном определении точки ее старта.

В ходе экспрессии гена 4,5SH РНК мыши с различными 5'-прилегающими последовательностями в культуре клеток HeLa было показано, что в клетке эффективную транскрипцию обеспечивает только геномная 5'-прилегающая последовательность гена 4,5SH РНК мыши. Следовательно, требования к структуре 5'-прилегающей последовательности для транскрипции гена 4,5SH РНК в живой клетке «строже», чем in vitro. Это свидетельствует о важности фланкирующих последовательностей в регуляции транскрипции данной малой РНК и их оптимизации для обеспечения высокоэффективной транскрипции в ходе эволюции. Работа осуществлена при поддержке РФФИ (грант 08-04-00350) и Программы РАН «Молекулярная и клеточная биология». Выражаю огромную благодарность своему научному руководителю, Дмитрию Александровичу Крамерову.

Влияние рельефа поверхности специфического РНК-узнающего модуля рибосомного белка L1 на его взаимодействие с РНК Костарева О.С., Кляшторный В.Г., Никонова Е. (Пущино, olgacat@inbox.ru) Для функционирования многих биологических систем важна способность белков специфически узнавать определенные участки на поверхности РНК, однако правила, по которым происходит это узнавание, слабо изучены. Объектом наших исследований является рибосомный белок L1. Он образует L1-выступ рибосомы, участвующий в высвобождении деацилированной тРНК из Е-сайта. Кроме того, он специфически связывается с мРНК и осуществляет регуляцию собственного синтеза по принципу «обратной связи».

Ранее в нашей лаборатории были определены пространственные структуры белка Lв свободном состоянии и в комплексе со специфическими фрагментами мРНК и рРНК.

Анализ данных комплексов показал, что на поверхности домена I белка L1 присутствует область, состоящая из консервативных аминокислотных остатков, формирующих с РНК консервативные, недоступные для растворителя, водородные связи.

Мы исследовали влияние рельефа поверхности данной области в домене I на взаимодействие белка L1 со специфическим фрагментом 23S рРНК. В консервативную триаду аминокислотных остатков Thr-Met-Gly методом сайт направленного мутагенеза вводились замены для того, чтобы получить бугорок (Thr/Phe) или впадину (Thr/Ala) на поверхности РНК-узнающего модуля, или оставить рельеф неизменным (Thr/Val). РНКсвязывающие свойства белка дикого типа и его мутантных форм анализировались методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Данный метод позволяет наблюдать взаимодействие белка с фрагментом РНК в реальном времени и определять кинетические константы ассоциации и диссоциации, а также кажущуюся константу диссоциации комплекса. Все вышеперечисленные замены приводили к значительному увеличению кинетической константы скорости диссоциации комплекса, а две из них – к уменьшению константы скорости ассоциации. Для объяснения полученных результатов были закристаллизованы мутантные формы белка и определены их пространственные структуры.

Анализ полученных структур показал, что две замены (Val и Ala) приводят к серьёзным конформационным изменениям в областях отдалённых от точки мутации. Замены треонина на аминокислотный остаток похожего или меньшего размера создавали бугорок на поверхности белка, уменьшая, таким образом, сродство мутантной формы белка к рРНК.

Замена на фенилаланин привела к изменениям лишь в области связывания с РНК и не оказала аллостерического эффекта на конформацию белка. Данная мутация уменьшила стабильность комплекса, но не изменила скорости его формирования.

Из полученных нами данных можно сделать вывод, что возникновение даже небольших (1-2А) дополнительных бугорков на поверхности белка, контактирующей с РНК, приводит к значительной дестабилизации комплекса, но не влияет на специфичность его формирования.

Работа финансировалась Программой поддержки ведущих научных школ (НШ4435.2010.4), Программой МКБ РАН, Федеральным агентством по науки и инновации (ГК № 02.740.11.0295), грантом РФФИ (№ 10-04-00618). Авторы выражают благодарность за научное руководство профессору, д.б.н. М.Б.Гарбер и к.б.н. Тищенко С.В.

Детекция и молекулярная филогения генов малых транс-действующих РНК у высших растений Красникова Мария Сергеевна (Москва,: marialaur@mail.ru) У растений, как и других эукариот, mi-РНК и ta-siРНК играют важнейшую роль в дифференцировке тканей организма и ответе на различные типы стрессов. Особенностью ta-siРНК является то, что они инактивируют не те гены, которыми кодируются (TAS гены).

Так, последовательное действие miR390 и tasiARF РНК контролирует активность генов факторов транскрипции ARF3 и ARF4.

Для расширения знаний о молекулярных механизмах образования и действия ta-siРНК в растениях, мы ставили задачу выявить разнообразие ранее не изученных генов ta-siРНК у ряда высших растений. Мы разработали новый метод детекции растительных ta-siРНК, биогенез которых зависит от miR390. Этот метод основан на ПЦР с использованием праймеров, комплементарных miR390, и геномных ДНК или кДНК в качестве матриц.

Для изучения эволюции TAS-генов, зависимых от miR390, мы изучили их разнообразие у растений семейства Solanaceae. Использование этого метода на ДНК табака и арабидопсиса выявило явные отличия среди продуктов реакции ПЦР. У арабидопсиса обнаруживается один главный продукт реакции длиной около 270 пн, а у табака нами получены 2 продукта 280 пн и 170 пн. Сходные по размеру фрагменты образовывались на матрицах ДНК ряда других представителей Solanaceae. Оказалось, что в дополнение к разнице в длине TAS-генов они отличаются также тем, что длинные гены содержат тандемно-дуплицированный район ta-siARF РНК и короткие гены содержат протяженный консервативный район в 3'-концевой области. Анализ баз нуклеотидных последовательностей растений выявил короткие и длинные TAS гены также в порядках Malpighiales, Fabales, Malvales, Sapindales, Asterales, Caryophyllales, Vitales.

Важное значение генов TAS в установлении адаксиально-абаксиальной полярности листовых примордиев у A. thaliana и Z. mays делает актуальным для решения проблемы фациальности листа поиск подобных генов и у других покрытосеменных. Особый интерес в этой связи представляют виды рода Senecio – S. spiculosus (Seph.) Rowl., S. articulatus (Haw.) Sch. Bip., различающиеся по фациальности листьев. У обоих видов Senecio нами выявлены TAS-подобные гены, структурно сходные с типичными TAS3 генами A. thaliana.

Это позволяет предположить, что TAS3 гены представляют собой универсальный компонент генома покрытосеменных растений, регулирующий становление фациальности листа в онтогенезе и, возможно, в эволюции. Важно, что S. spiculosus с унифациальными листьями имеет те же гены TAS3, что и S. articulatus, которому свойственны бифациальные листья.

Следовательно, развитие унифациальных листьев S. spiculosus не обусловлено простой делецией генов регуляторных tasiARF РНК. Их последующее преобразование в унифациальный орган, вероятно, вызвано различиями в транскрипционной активности генов TAS3 в разных участках развивающегося листа.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 09-04-00707-a и 09-04-01324.

Структурно-функциональное разнообразие хитин-связывающих доменов растительных пероксидаз и их практическое применение Кузьмина Ольга Ильинична (Уфа, olya.kuzmina.ibg@gmail.com) В настоящее время в биотехнологической промышленности значительный интерес представляют специфические нейтральные пептиды, способные афинно- или ионообменно связываться с биологическими матрицами. Этот интерес связан с возможностью создания на их основе химерных конструкций, с помощью которых из множества белков, синтезируемых в рекомбинантных организмах, можно фракционировать целевые белки с меньшим количеством этапов. В этих условиях домены, взаимодействующие с хитином, представляют значительный интерес, поскольку этот биополимер является относительно распространенным и дешевым. Использование ионообменно – взаимодействующих с биологической матрицей пептидов, например, таких как у хитин-специфичных пероксидаз, является перспективной наряду с ионообменной хроматографией. В связи с этим цель работы состояла в анализе структуры хитин-связывающего домена гена анионной пероксидазы пшеницы и определению функциональной активности этого фрагмента.

Фрагмент гена пероксидазы, предположительно кодирующий хитинспецифичный домен, был выделен и просеквенирован. Анализ просеквенированного ампликона, полученного с ДНК Triticum militinae и Triticum compactum показал его гомологию до 98% с геном пероксидазы ТС 151917 Triticum aestivum, а также с геном prx126 пероксидазы до 81% риса Oryza sativa (japonica cultivar-group). Нами получена генно-инженерная конструкция, созданная на основе вектора pCambia 1305.1 с репортерным геном GUS, находящегося под контролем 35S промотора, для направленного клонирования смыслового фрагмента хитинсвязывающего сайта гена анионной пероксидазы. Трансформированные бактериальные колонии E. coli активно синтезировали ряд белков, отсутствующих в «диком» штамме, в том числе, проведенный SDS-форез выявил белок размером ~110 кДа, который, по нашему предположению, и является трансформированным химерным белком. Экспериментально доказано, что химерный белок -глюкуронидазы, содержащий хитин-связывающий домен пероксидазы, обладает способностью взаимодействовать с хитином.

Таким образом, в этой работе нам удалось синтезировать фрагмент кодирующей части гена пероксидазы в химерной конструкции с геном -глюкуронидазы, продукт которого обладал способностью взаимодействовать с хитином. Полученные данные доказывают то, что у хитин-специфичных пероксидаз растений на поверхности белка существуют непосредственные сайты, ответственные за их связывание с хитином патогенных грибов.

Полученная генно-инженерная конструкция позволяет использовать его в практических целях, например, для создания химер с целевыми белками и дальнейшего их фракционирования с помощью аффинно-ионообменной хроматографии на хитиновом сорбенте. Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 08-04-90259-Узб-а и Всероссийского молодежного научного инновационного конкурса «УМНИК» (2009).

Автор выражает признательность д.б.н. Максимову И.В. за помощь в подготовке тезисов.

Разработка подхода для изучения активации трансляции инкапсидированной РНК Х вируса картофеля в процессе межклеточного транспорта Кулёмин С.Е., Смирнов А.А. (Москва, sleiden@yandex.ru) Ранее в нашей лаборатории было показано, что РНК Х-вируса картофеля (ХВК), находящаяся в составе вирусной частицы, не доступна для трансляции in vitro.

Фосфорилирование белка оболочки (БО) в составе частицы ХВК, или связывание с ней транспортного белка 1 (ТБ1) ХВК активирует трансляцию инкапсидированной РНК in vitro.

Нашей следующей задачей является изучение активации трансляции инкапсидированной РНК ХВК in vivo. Имеющиеся на сегодняшний день данные, позволяют предположить, что РНК ХВК транспортируется из клетки в клетку как в составе вириона, так и «однохвостой частицы», представляющей собой не полностью собранный вирион, связанных с ТБ1 ХВК.

Одной из возможных функций ТБ1 является обеспечение активации трансляции вирусной РНК, входящей в состав транспортной формы, после её перехода в соседнюю незараженную клетку.

Для изучения этого процесса in vivo необходимо иметь возможность независимо детектировать два события: переход транспортной формы вируса в соседнюю незаражённую клетку и последующую трансляцию содержащейся в её составе РНК.

Pages:     | 1 |   ...   | 53 | 54 || 56 | 57 |   ...   | 85 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.