WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 52 | 53 || 55 | 56 |   ...   | 85 |

Вставку кДНК, кодирующую 30-кДа фрагмент MTR BYV, клонировали в вектор р30В_GFP. Этот вектор содержит, под Т7 промотором, инфекционную кДНК генома вируса табачной мозаики (TMV), включая репортерный ген зелёного флюоресцентного белка (GFP).

Ген репортерного белка в р30В_GFP заменяли на вставку, кодирующую 30-кДа фрагмент метилтрансферазы BYV, и получали вектор р30В_MTR. Кепированные Т7 транскрипты химерного генома TMV использовали для инокуляции (заражения) растений Nicotiana benthamiana. На 7–9 день после инокуляции наблюдали появление симптомов листовой мозаики. В инокулированных листьях, проводящих тканях стебля и листьях верхнего яруса контрольных растений, заражённых транскриптами р30В_GFP, наблюдалась флюоресценция репортерного белка. Экспрессию целевой вставки 30К MTR BYV определяли с помощью иммуноблотов суммарных белков растений с моноклональными антителами к MTR BYV, ранее полученными в нашей лаборатории. На иммуноблотах белков из растений, инокулированных р30В_MTR, выявлялась специфическая зона белка ожидаемого размера (30 кДа), которая отсутствовала в контролях – на дорожках белков из здоровых растений и растений, инокулированных р30В_GFP. Таким образом, нами показана экспрессия 30К MTR BYV in vivo с помощью вектора на основе вируса табачной мозаики. Полученные результаты открывают возможность идентификации клеточных органелл, к которым может прикрепляться MTR BYV, и тестирования возможной трансформации мембран клетки, сопровождающей индукцию мультивезикулярных структур.

Получение и анализ специфичности антител к «узловой» структуре между белком VPg и РНК пикорнавирусов Гаврюшина Е.С., Зацепин Т.С., Торопыгин И.Ю. (Москва, esgavryushina83@mail.ru) К семейству пикорнавирусов относятся вирусы полиомиелита, энцефаломиокардита и Менго, поражающие центральную нервную систему, вирусы обыкновенной простуды человека, вирусы ящура и гепатита А. Актуальность работы определяется необходимостью создания новых инструментов для исследования механизма пикорнавирусных инфекций.

Особый интерес представляет изучение инициации репликации генома пикорнавирусов, а также калици- и потивирусов, у которых 5’-концевой остаток уридиловой кислоты РНК ковалентно связан с остатком тирозина белка VPg и праймером для синтеза РНК является либо сам белок VPg, либо его предшественник. В данной работе в качестве такого инструмента предложены антитела к «узлу» ковалентной связи Tyr-pUp, которые могут позволить детально исследовать процесс инициации репликации генома пикорнавирусов и создать новые методы диагностики и профилактики пикорнавирусных заболеваний.

Для получения препарата антител к «узлу» ковалентной связи между белком VPg и РНК пикорнавирусов было синтезировано имитирующее его модельное соединение. Структура модельного соединения была доказана методами ОФ ВЭЖХ, УФ-спектроскопии, ионпарной хроматографии и масс-спектрометрии. Был синтезирован антиген – конъюгат модельного соединения с лизоцимом, данным антигеном иммунизовали кролика, получали антисыворотки и подвергали их сульфат-аммонийному фракционированию и аффинной хроматографии на протеин G сефарозе. Специфичность антисывороток и препаратов антител на всех стадиях очистки определяли методом «иммунозолото» на нитратцеллюлозных мембранах. Было показано, что антитела к модельному соединению специфически узнают РНК пикорнавирусов (вируса энцефаломиокардита и вируса Менго). Методом флуоресцентной микроскопии на клетках HeLa, инфицированных вирусом обыкновенной простуды человека 2, было показано, что антитела к «узловой» структуре специфически узнают сайты инициации репликации пикорнавирусной РНК.

Данное исследование было проведено при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант 06-04-90609) и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (гос. контракт № 5635Р/8091). Авторы выражают благодарность профессору Ю.Ф. Дрыгину за руководство и помощь в проведении экспериментов, В.Н. Ташлицкому за проведение ион-парной хроматографии модельного соединения, И.Ю. Торопыгину за проведение масс-спектрометрии модельного соединения, П.В. Лидскому и О.В. Микитась за предоставление культуры клеток HeLa B, профессору Д. Блаасу и А.М. Пикль-Херк за предоставление препарата вируса обыкновенной простуды человека 2 и особую благодарность С.А. Брянцевой за анализ инфицированных и неинфицированных клеток HeLa B методом иммунофлуоресцентной микроскопии.

Идентификация и анализ белков внутренней мембраны митохондрий сердца Bos taurus масс-спектрометрическими методами Дайниченко Екатерина Владимировна (Москва, danone2006@yandex.ru) Впервые митохондрии обнаружены в виде гранул в мышечных клетках в 1850 году (Taylor et al., 2003), а в дальнейшем было показано, что эти органеллы являются основными поставщиками энергии в клетке (до 95% всего АТФ клетки). Вследствие своих функциональных особенностей митохондрии содержат от 1500 до 3000 белков, а именно:

белки окислительного фосфорилирования, цикла Кребса, метаболизма липидов, рибосом и так далее – причём, большинство из них кодируются в ядерном геноме. Трудность идентификации такого количества белков была преодолена путём разработки методов выделения и идентификации протеомных подмножеств – протеомов субкомпартментов.

В результате такого анализа было достигнуто упрощение анализируемых смесей, что сделало возможным обнаружение «минорных» белков, которые при изучении целой органеллы на фоне других могли оставаться незамеченными. В настоящей работе проводилось выделение смеси белков внутренней мембраны митохондрий, которые в условиях эксперимента находились в замкнутых мембранных везикулах (СМЧ – субмитохондриальные частицы), причем могли образовываться везикулы, с нативной ориентацией белков мембране, а также «вывернутые» везикулы с обратной ориентацией мембранных белков. СМЧ были обработаны трипсином с целью получения экстрамембарнных пептидов. Поскольку трипсинолизу была подвергнута смесь из обоих типов СМЧ, то в результате такой обработки ожидалось получение пептидов, относящихся как к наружным, так и к внутренним экстрамембранным фрагментам белков внутренней мембраны митохондрий. Для экстракции и фрагментации трансмембранных компонентов белков был выбран другой способ обработки СМЧ – метод расщепления бромцианом по остаткам метионина с последующей модификацией остатков гомосеринлактона этилендиамином. Далее смесь пептидов подвергалась последовательным катионобменному и обращённофазовому фракционированиям, сопряжённым с тандемной масс-спектрометрией.

Ключевой частью эксперимента был поиск белков по базам данных аминокислотных последовательностей. При этом поиск белков проводился с учётом как используемых способов расщепления белков (например, гидролиз трипсином), так и возможного неспецифического расщепления. Это позволило значительно расширить список идентифицированных белков.

В результате удалось достоверно определить 305 белков, для которых был проведён анализ выполняемых функций и локализации белков в клетке.

Автор выражает благодарность научному руководителю доценту, к.х.н. Гринкевичу В.А.

за помощь в проведении экспериментов и подготовке тезисов.

Исследование генетической вариабельности локуса ARTS1, фактора генетического риска развития спондилоартритов Дородных Валерия Юрьевна (Москва, v.dorodnykh@gmail.com) В настоящее время с помощью ассоциативного анализа был определен ряд генов, аллели которых являются факторами риска развития спондилоартритов. Одним из этих генов является ARTS1, кодирующий аминопептидазу семейства М1, которая участвует в процессе презентации пептидов на главном комплексе гистосовместимости, а также в регуляции чувствительности клеток провоспалительных интерлейкинов. Ранее была показана строгая ассоциация со спондилоартритами ряда несинонимичных однонуклеотидных замен в кодирующей части гена ARTS1, которые, предположительно, влияют на функциональные свойства продукта данного гена.

В нашей работе проводилось исследование вариабельности локуса ARTS1 по пяти маркерам, для которых была показана наиболее строгая ассоциация. Нами разработана оригинальная ПЦР-система для генотипирования, включающая серию аллельспецифических праймеров. Генотипирование проведено для положительных по HLA B-представителей двух выборок: больных спондилоартритом (66 человек) и здоровых доноров (76 человек).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программ Haploview 4.1 и Genetic Data Analysis 1.0. Определены частоты встречаемости 10 аллелей среди представителей обеих групп. Показано статистически достоверное снижение частоты встречаемости минорных аллелей несущих маркеры rs(0.12 vs 0.24, P=0.018) rs17482078 (0.11 vs 0.21, P=0.02), rs2287987 (0.09 vs 0.22, P=0.01) у больных спондилоартритом. Кроме того, показано значительное снижение гетерозиготности по указанным маркерам в группе больных.

С использованием результатов генотипирования и анализа структуры кДНК, для группы пациентов, страдающих спондилоартритом, были определены гаплотипы по пяти маркерам.

Выявлены два преобладающих гаплотипа AGGGG и AAGGC, которые составляют 44% и 23%, от общего числа проанализированных гаплотипов, соответственно. Остальные гаплотипы составляют менее 10%.

Выражаю благодарность своему научному руководителю Лебедеву Юрию Борисовичу, а также всему коллективу лаборатории «Сравнительной и функциональной геномики» ИБХ РАН.

Оценка структуры редактируемого домена криптогена Aу представителей рода Leptomonas Ефимова Надежда Сергеевна (Москва, shordome@gmail.com) Уникальной особенностью структуры митохондриального генома трипаносоматид (группа Euglenozoa) является наличие в нем криптогенов. Последовательность криптогена не содержит полноценной открытой рамки считывания функционального белка. Образование транслируемой мРНК из пре-мРНК происходит в процессе уридилового редактирования, который заключается во вставке или удалении остатков уридиловой кислоты при участии особого вида молекул РНК – гидовых РНК. Участок криптогена, на протяжении которого происходит редактирование, называется редактируемым доменом. Размер и структура редактируемых доменов разных генов и одного гена у разных видов может варьировать.

Так для гена субъединицы 6 АТФазы (A6) характерно редактирование по всей длине криптогена для рода Trypanosoma, представители которого являются дигенетиками.

У представителей рода Leishmania редактируется 5' половина криптогена, а у Leptomonas seymouri размер редактируемого домена уменьшается. Эволюция структуры редактируемых доменов на сегодня недостаточно изучена. Задача данного исследования выяснить, варьирует ли размер редактируемого домена конкретного криптогена у представителей одного рода моноксенных трипаносоматид Нами был выбран род Leptomonas, поскольку по современным генно-систематическим данным (в частности, на основании филогенетического дерева, построенного по первичной структуре гена 18S рРНК) род не является монофилетичным. Интересно – отражается ли это в структуре редактируемого домена исследуемого криптогена В данной работе нами была установлена первичная структура криптогена субъединицы АТФазы (А6) у трех видов рода Leptomonas: Leptomonas pyrhocorrys, Leptomonas collosoma, Trypanosomatidae (Leptomonas) sp. (WSD). В качестве видов для сравнения взяты два представителя других родов Leishmania tarentolae и Crithidia fasciculata и представитель данного рода L. seymouri, для которых известны первичная структура криптогена и отредактированная мРНК. Проведенное выравнивание первичных структур показывает, что длина редактируемого домена различается у разных представителей рода. На основании структуры редактируемого домена исследуемого криптогена выделяются две группы внутри рода Leptomonas: в первую попадают L. pyrhocorrys и L. seymouri, во вторую – L. collosoma и Trypanosomatidae sp. (WSD), у которых размер редактируемого домена значительно уменьшен. Следует отметить, что у Trypanosomatidae sp. (WSD), в отличие от всех других представителей рода в криптогене предсуществует стартовый ATG кодон. На основании полученных нами данных и данных литературы можно предположить, что представители второй группы могут относиться к другому роду.

Изучение транскриптома Mycobacterium avium при заражении мышей линий I/St и BИгнатов Дмитрий Васильевич (Москва, dima.ignatov@gmail.com) Mycobacterium avium – факультативный внутриклеточный патоген, вызывающий ряд серьёзных заболеваний: диссеминированные инфекции у людей с иммунодефицитом, болезнь Джонса у жвачных животных и, вероятно, болезнь Крона у человека. Недавно в Центральном научно-исследовательском институте туберкулёза РАМН была разработана модель иммунопатологии, позволяющая проследить ход инфекционного процесса.

Заражению M. avium подвергались две линии мышей. Линия I/St устойчива к инфекции, вызываемой M. avium, а линия В6 восприимчива к инфекции. В мышах линии В6, в отличие от мышей линии I/St, развивается тяжёлое поражение лёгочной ткани. Восприимчивость мышей линии В6 связана с тем, что они несут нефункциональный аллель гена Nramp1, кодирующего ионный насос, выкачивающий катионы дивалентных металлов из пространства эндосомы, в которой персистирует M. avium. Целью проведенного исследования стал анализ транскрипции всех генов M. avium в ходе инфекционного процесса в резистентной и восприимчивой к заболеванию линиях мышей. В работе были использованы мыши линии I/St, устойчивые к инфекции M. avium, и мыши линии B6, чувствительные к инфекции. Тотальная РНК из легких мышей обеих линий была выделена через 13 недель с момента заражения M. avium. На матрице тотальной РНК была синтезирована кДНК. Методика Coincidence cloning, заключающаяся в денатурации и ренатурации кДНК с избытком бактериальной геномной ДНК позволила выделить фракцию бактериальной кДНК. Проведено пиросеквенирование полученных образцов, данные обработаны биоинформатически и статистически. В результате анализа данных были получены сведения о качественных и количественных отличиях в профилях транскрипции генов бактерии при персистировании в резистентной и восприимчивой к инфекции линиях мышей. На основании этих отличий сделаны выводы об изменении метаболизма M. avium.

Pages:     | 1 |   ...   | 52 | 53 || 55 | 56 |   ...   | 85 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.