WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 85 |

Гибридные конструкции содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие:

тиоредоксин, гистидиновый таг, сайт расщепления высокоспецифичной протеиназы (энтерокиназы в случае dKCNE1 и тромбина в случае KCNE3) и гибкие линкеры. Собранные гены клонированы в экспрессионный вектор pGEMEX-1 под контроль Т7 промотора.

Процесс культивирования рекомбинантных штаммов (BL21(DE3)pLysS) оптимизирован для «богатой» и «бедной» сред (TB и М9, соответственно). Процесс очистки dKCNE1 и KCNEвключает следующие основные стадии: металл-хелатная аффинная хроматография (МХАХ), гидролиз гибридного белка, повторная МХАХ и дополнительная хроматография (ионообменная – в случае dKCNE1; гидрофобная – в случае KCNE3). Очистка KCNEпроведена с использованием МХАХ и гидрофобной хроматографии. Итоговый выход для 15 всех белков и их N-, N-13C- производных составляет не менее 10 мг/л культуры. На данный момент предложенный способ экспрессии генов и очистки МБ уже позволил получить структурную информацию о KCNE3, что свидетельствует в пользу высокого качества полученных по представленной технологии белковых препаратов.

Авторы выражают благодарность к.б.н. А.А. Шульге, к.б.н. Я.С. Ермолюку, к.х.н. Р.В.

Тихонову, к.х.н. Э.В. Бочарову, д.х.н. А.С. Арсеньеву и акад. М.П. Кирпичникову за консультации, помощь и финансирование при проведении настоящей работы; поддержке грантов РФФИ и Российского Федерального Агентства по Науке и Инновациям.

Бактериальный синтез и очистка трансмембранных фрагментов рецепторных тирозинкиназ для структурно-функциональных исследований Гончарук М.В., Гончарук С.А. (Москва, goncharuki@gmail.com) Рецепторные тирозинкиназы занимают центральное место в ключевых процессах жизнедеятельности клетки. Трансмембранные (ТМ) домены участвуют в гомо- и гетеродимеризации этих белков. Значительная часть современных лекарственных препаратов направлена на рецепторные протеин киназные системы, однако детальные механизмы функционирования последних до конца не изучены. Понимание аспектов, связанных с ролью ТМ доменов в активации и функционировании рецепторных тирозинкиназ, расшифровка их пространственной структуры поможет понять на молекулярном уровне процессы, происходящие в живой клетке и заложит основу рационального дизайна лекарственных препаратов нового поколения.

Для исследования выбраны рецепторы эпидермального фактора роста (ErbB2, ErbB4) и рецептор фактора роста фибробластов в норме (FGFR3) и патологии (с точечными мутациями G380R и A391E). Разработана методика препаративного бактериального 15 получения ТМ доменов этих белков (ТМ пептидов), а также их N-, N-13C- меченых производных для структурно-функциональных исследований. Синтетические гены ТМ пептидов экспрессированы в составе с тиоредоксином А Escherichia coli (TrxA).

Нуклеотидные последовательности каждого пептида собраны из химически синтезированных олигонуклеотидов и подсоединены к 3'–концу гена TrxA при помощи ПЦР.

На стыке двух генов введены нуклеотидные последовательности, кодирующие шесть гистидинов, сайт узнавания легкой цепи энтерокиназы человека и гибкие линкеры. На N- конце TrxA размещен H-таг, устраняющий токсичность гибридного белка по отношению к клетке-хозяину. Синтетические гены гибридных белков клонированы в вектор pGEMEX-под транскрипционный контроль Т7 промотора. Культивирование рекомбинантных штаммов E.coli проведено на минимальной солевой среде М9. При необходимости 15 15 15 получения N- (или N-13C-) меченых белков использовали NH4Cl (или NH4Cl и C-глюкозу). Протокол очистки пептидов включал металло–хелатную аффинную и ионообменную хроматографии. Гибридные белки гидролизованы легкой цепью энтерокиназы человека. Итоговый выход пептидов и их 15N-, 15N-13C- производных составил не менее 7 мг/л культуры. Высокая степень чистоты (не менее 97%) и идентичность всех полученных белков соответствующим целевым пептидам подтверждена при помощи гельэлектрофоретического и масс-спектрометрического анализов. Очищенные белковые препараты готовы для получения структурно-динамической информации о их гомо- и гетеродимерных комплексах методом гетероядерной спектроскопии ЯМР высокого разрешения. Так, разработанная стратегия получения пептидов позволила получить первую в мире структуру высокого разрешения ТМ доменов ErbB2 в димерном состоянии.

Авторы выражают благодарность к.б.н. Шульге А.А., к.б.н. Ермолюку Я.С., Ткач Е.Н., к.х.н. Бочарову Э.В., д.х.н. Арсеньеву А.С. и акад. Кирпичникову М.П. за консультации, помощь и финансирование при проведении настоящей работы; поддержке грантов РФФИ и Российского Федерального Агентства по Науке и Инновациям.

Микроинкапсулирование альфа-интреферона на водорастворимом хитозане Губайдуллина Альфия Азаматовна (Уфа, alphiya05@rambler.ru) Получены образцы микрочастиц хитозана методом осадительной коацервации и ионотропного гелеобразования. Микрочастицы хитозана представляют собой суспензию, состоящую из гранул разного размера (1-3 мкм). Микрочастицы в основном существуют в виде небольших скоплений, ассоциированных участков.

Взаимодействие альфа-интерферона с микрочастицами исследовали в зависимости от концентрации белка, от времени сорбции. Образцы микрочастиц хитозана, полученные методом ионного гелеобразования показали лучшую сорбцию по сравнению с образцами, полученных методом солевого высаживания. Довольно большую сорбционную способность до 640 мкг белка/мл микрочастиц вероятнее всего можно объяснить образованием надмолекулярных структур, либо небольших ассоциированных участков, которые способны связывать белок в межмолекулярном пространстве. Изучение продолжительного времени взаимодействия белка с микрочастицами хитозана показало незначительное влияние на количество сорбируемого белка. Основная часть загружаемого интерферона сорбируется уже в первые 4 часа, а в последующие часы от 4 до 24 часов сорбируется от 0 до 2,9% основного количества альфа-интерферона.

При изучении десорбции белка во времени в течение 24 часов, было установлено, что основная часть десорбируемого белка высвобождается в первый же час инкубирования образцов при 37°С. Динамику высвобождения интерферона из микрокапсул определяли на модельном опыте на кроликах породы Шиншилла. При инъекции рекомбинантным интерфероном-альфа в концентрации 800 мкг/мл к 8 часам наблюдается почти полное выведение интерферона, а концентрация интерферона, обнаруживаемая в сыворотке крови кролика после иммунизации образцом, полученным методом осадительной коацервации, все еще является лечебной. Хотя образцы, полученные методом ионотропного гелеобразования показывали наилучшую сорбцию белка и наименьшую десорбцую in vitro, эффекта пролонгации они не оказывают, вероятнее всего из-за необратимого связывания микрочастиц с интерфероном, который привел к денатурации либо дезактивации.

На основании исследований физико-химических свойств и биологической активности можно сказать, что микрочастицы хитозана с М.м. 100 кДа, полученные методом солевого высаживания являются оптимальными для получения пролонгированной формы альфаинтерферона и, вероятнее всего, для многих других белковых препаратов.

Исследование клеток нейронов в культуре при патологии и в норме методами биофизики и нанобиотехнологии Дзюбенко Егор Вячеславович (Москва, ejeek@yandex.ru) На основные свойства нервной клетки – возбудимость и проведение нервного импульса сильно влияет морфологическое и энергетическое состояние клетки (Klapstein et al., 2001;

Costa et al., 2008). Цитоскелет отростков нервных клеток – сложный комплекс нейрофиламентов, микротрубочек, актиновых филаментов и ассоциированных с ними белков, играющий важнейшую роль в процессах направленного роста, стабилизации и регуляции нейритов (Dent, Gertler, 2003). Таким образом, цитоскелет нейритов является мишенью исследования нейродегенерации в целом и аксональной дегенерации в норме и при патологии.

Изменение мембранного потенциала митохондрий, их распределение и форма, отражает физиологическое состояние клетки (Sureda et al., 1997). Метод атомной силовой микроскопии высокоэффективен при исследовании тонкой морфологии нативной нервной клетки в среде роста, при измерении упругих свойств мембраны и в целях нанохирургии (Xiong et al., 2009; McNally, Ben Borgens, 2004).

В ходе данной работы были получены первичные культуры клеток нейронов эмбрионов курицы Е8–Е13, диссоциированные и органотипичные. С точки зрения морфологии проведено исследование цитоскелета нервных отростков методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии при использовании цитохимических и иммуноцитохимических подходов. Рассмотрена общая морфология клеток, их отростков и конусов роста с помощью атомной силовой микроскопии и сделана попытка измерения упругих свойств мембраны различных областей клетки. Применен потенциал-чувствительный флуорофор родамин для исследования мембранного потенциала митохондрий. Кроме того, применена модель глутаматной цитотоксичности при изучении дегенеративных процессов в нервной клетке.

Влияние дитиотреитола на Н+-транспортирующие системы плазмалеммы клеток Chara: связь с нефотохимическим тушением флуоресценции Додонова С.О., Крупенина Н.А. (Москва, dodonova.sveta@gmail.com) В освещенных клетках водоросли Chara corallina величина нефотохимического тушения флуоресценции (NPQ), связанная с градиентом рН на тилакоидной мембране (ТМ), четко скоординирована с профилем рН в апопласте (рНo). Неоднородный профиль рН у поверхности клетки обусловлен чередующимися доменами плазмалеммы с активным выведением Н+ и с Н-зависимым электрогенным поступлением Н+ в клетку по протонным каналам в щелочных зонах. В участках клетки с рНo~10 уровень NPQ повышен в связи с закислением люмена и высоким градиентом pH на ТМ. Известно, что NPQ ослабляется при действии дитиотреитола (ДТТ – агент, препятствующий образованию S-S связей в белках, известный как ингибитор виолаксантин-деэпоксидазы). В работе прослежено влияние ДТТ на NPQ в хлоропластах и встречно направленные трансмембранные потоки Н+ в щелочных и кислых зонах клеток Chara. Об активности Н+ помпы и Н+ каналов судили по сдвигам рНo в соответствующих примембранных областях после остановки входящего и выходящего потоков Н+, вызванной генерацией потенциала действия (ПД). Значения коэффициента NPQ получены с использованием метода насыщающих световых импульсов на базе микрофлуорометра Microscopy PAM (Walz); рН у поверхности клетки измеряли с помощью сурьмяного рН-микроэлектрода. Инкубация клеток Chara в среде с 2мМ ДТТ приводила к сдвигу S-образных световых кривых NPQ в область высоких интенсивностей света как в кислой, так и в щелочной зонах. Такое снижение уровня NPQ можно объяснить уменьшением количества зеаксантина в антенне фотосистемы 2. В контрольных опытах амплитуда ПД-индуцированных изменений pH в щелочных участках была в несколько раз больше, чем в кислых. При обработке клеток ДТТ амплитуда изменений pH в щелочных зонах заметно уменьшалась, а в кислых, наоборот, увеличивалась. Вероятно, это связано с тем, что ДТТ снижает проводимость в щелочных областях клетки Chara и не влияет на Н+ насос в кислых зонах. Результаты работы показывают, что снижение тушения в хлоропластах под действием ДТТ сопровождается снижением рНo как в щелочных, так и в кислых зонах клетки. Эти наблюдения подтверждают наличие сложных связей между NPQ и Н+-транспортирующей активностью плазмалеммы. Можно предполагать, что ДТТ влияет как на протонные каналы плазмалеммы, так и на взаимодействия хлоропластов с плазмалеммой.

Изучение трансфекции клеток в культуре полиплексными нанокомплексами с лигандной специфичностью Дурыманов Михаил Олегович (Москва, mdurymanov@gmail.com) В целях генной терапии рака необходимо создание носителей (векторов), которые бы обеспечивали защиту, направленность и специфичность доставки генов в клетки-мишени.

В настоящее время все большее внимание уделяется созданию невирусных систем доставки, в том числе полиплексов – нанокомплексов доставляемой ДНК с положительно заряженным полимером, например, полиэтиленимином (ПЭИ). ПЭИ и конъюгаты на его основе связываются с отрицательно заряженной ДНК, компактизуют её и предохраняют от действия нуклеаз в условиях in vivo. С целью снижения токсичности полиплексов используют конъюгаты ПЭИ с полиэтиленгликолем (ПЭГ). Кроме того, к комплексу ПЭИ-ПЭГ может быть присоединён дополнительный компонент, придающий специфичность для доставки полиплексов в раковые клетки. Для меланом с повышенной экспрессией меланокортиновых рецепторов первого типа таким компонентом может служить пептид, способный взаимодействовать с ними с высокой аффинностью, подобно -меланоцит-стимулирующему гормону (-МСГ).

В данной работе была показана высокая трансфицирующая способность полиплексов, полученных в нашей лаборатории, на клетках мышиных меланом двух линий – В16F1 и Клаудмана S91 (клон М3). В качестве репортерного гена был выбран ген зелёного флуоресцентного белка. Анализ результатов трансфекции проводили при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа Carl Zeiss 510 META NLO.

Обнаружено, что эффективность трансфекции зависит от соотношений компонентов в составе полиплекса и её максимальное значение составляет около 80% и 90% для клеток В16F1 и М3 соответственно. Для увеличения трансфицирующей способности и специфичности доставки были синтезированы конъюгаты блок-сополимеров, содержащие МСГ-подобный пептид. Была проведена оценка физико-химических параметров полиплексов, полученных на основе данных конъюгатов: их размеры, -потенциал, действие на мембраны. Изучена трансфицирующая способность полиплексов на основе конъюгатов блок-сополимеров ПЭИ-ПЭГ-(МСГ-подобный пептид) и ПЭИ-ПЭГ на линиях клеток меланом in vitro при разных количественных соотношениях конъюгата и переносимой ДНК.

Проведенные эксперименты показали, что на клетках линии М3 при соотношениях N/P (отношение количества амино- и иминогрупп ПЭИ к числу фосфатных групп ДНК) 20 и эффективность трансфекции полиплексами, содержащими МСГ-подобный пептид, достоверно выше, чем при трансфекции полиплексами без пептида. Для клеток В16Fподобный эффект наблюдался только при N/P 20. Было доказано, что увеличение эффективности трансфекции определяется присутствием МСГ-подобного пептида.

Добавление избытка свободного -МСГ уменьшало трансфекцию при помощи полиплексов с МСГ-подобным пептидом за счет конкуренции за рецептор на клетках меланом, но не на клетках почки эмбриона человека линии НЕК293, у которых отсутствуют меланокортиновые рецепторы.

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 85 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.