WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 46 | 47 || 49 | 50 |   ...   | 85 |

Целью настоящей работы было исследование протеолитической активности во внутриклеточном экстракте P.mirabilis. В качестве субстратов для определения активности использовали азоказеин и актин, выделенный из ацетонового порошка мышц кролика. Исследовалась динамика роста бактерий и динамика появления активности по отношению к азоказеину и актину, а также чувствительность внутриклеточной протеолитической активности к различным ингибиторам. Внутриклеточный экстракт получали из отмытых клеток методом замораживания-оттаивания. Активность по отношению к актину определяли электрофоретически.

Исследование динамики роста бактерий показало, что на среде LB с аэрацией бактерии выходят на стационарную фазу роста на 9-10 час культивирования. Поэтому для определения активности брали клетки на экспоненциальной фазе роста (8 час), на ранней (16 час) и поздней стационарной фазах роста (24 и 48 час). Показано, что активность по азоказеину и актину появляется уже на 8 час и присутствует в клетках на всех стадиях роста.

Показано, что актин расщепляется ограниченно с образованием большого фрагмента с молекулярной массой 36 кДа.

Ингибиторный анализ с использованием о-фенантролина – ингибитора металлопротеиназ и PMSF – ингибитора сериновых протеиназ, показал, что основная протеолитическая активность в клеточном экстракте определяется металлопротеиназой (85% активности по азоказеину) и незначительная часть обусловлена сериновой протеиназой (15%).

Расщепление актина с образованием 36 кДа фрагмента полностью подавляется офенантролином и не подавляется PMSF. Таким образом, во внутриклеточном экстракте обнаружены металлопротеиназы и сериновые протеиназы. Орграниченный протеолиз актина обусловлен действием металлопротеиназы. Автор выражает признательность доценту, к.б.н. Мардановой А.М. за помощь в подготовке тезисов.

Селекция микроорганизмов-активаторов деструкции растительных остатков Муравьева Юлия Валерьевна (Астрахань, julia_mur@mail.ru) Компостирование представляет собой самый продуктивный прием переработки отходов растительного происхождения, полученный продукт – компост является экологически чистым органическим удобрением, а выделенный представители микроорганизмов могут быть использованы в качестве основных составляющих для создания компостной закваски.

Биоконверсия растительного сырья в продукты для сельского хозяйства основана на воздействии ферментов микроорганизмов на структуру растительных остатков. В связи с этим изучение целлюлозолитической активности микроорганизмов актуально и своевременно.

Целью работы являлось выделение бактерий-деструкторов растительных остатков и исследование их ферментативной активности. Объектами исследования послужили компосты на основе: газонной травы, тростника южного, бумаги. Наибольшая численность микроорганизмов наблюдалась в накопительной культуре с компоста, богатого зелёными растительными остатками, а наименьшая – в накопительной культуре с компоста, составленного из бумажных остатков. На среде Гетчинсона выделены 15 изолятов, из которых по способности к росту в чистой культуре отобраны 5 изолятов. Определение целлюлазной активности штаммов показало, что наибольшей активностью обладают 3 чистые бактериальные культуры, выделенные с компоста, в состав которого входят остатки тростника. Как известно, растительные отходы являются смешанными источниками углерода и азота, необходимыми для компостирования. Оптимизация процесса компостирования может быть обеспечена реализацией – соотношение С : N в субстрате 25–30 : 1. Из компостируемых остатков выделены чистые культуры свободноживущих азотфиксаторов, которые впоследствии можно использовать в качестве одного из компонентов компостной закваски и дополнительного источника пополнения азота. Данные по изучению азотфиксирующей активности выделенных штаммов методом газовой хроматографии показали, что наиболее активными являются два штамма (23,31 мкг N2/ч и 13,56 мкг N2/ч).

Таким образом, применение микроорганизмов, обладающих высокой биохимической активностью, возможно в качестве активаторов для создания компостной закваски, которая позволит увеличить скорость деструкции растительного сырья и получить органическое удобрение хорошего качества, что одновременно решит проблему утилизации отходов сельского хозяйства. Особая благодарность выражается научному руководителю д.б.н. профессору Сопруновой Ольге Борисовне за помощь в подготовке тезисов.

Выявление и характеристика метаболитов растений, индуцирующих систему кворума Pectobacterium atrosepticum SCRIМухамедова Л.Н., Горшков В.Ю., Мухаметшина Н.Е. (Казань, snusmumriick@gmail.com) Процесс взаимодействия фитоассоциированных бактерий и растений предполагает осуществление множества приспособительных реакций двух организмов, необходимых для распознавания партнера и адекватного реагирования на него. У фитопатогенных микроорганизмов вирулентность регулируется на популяционном уровне посредством межклеточной коммуникации, примером которой является ацилгомосерин лактон (АГЛ)-зависимая система «кворум сенсинга». Функционирование системы кворума основано на синтезе и восприятии АГЛ, образование которых регулируется по принципу положительной обратной связи.

В наших экспериментах показано, что у грамотрицательной бактерии, вызывающей заболевание «черная ножка» картофеля – Pectobacterium аtrosepticum SCRI1043, система кворума, в дополнение к классическому механизму, может активироваться метаболитами растений. При культивировании бактерий P. аtrosepticum SCRI1043 на минимальной среде в присутствии тканей растений – представителей семейства пасленовых – табака и картофеля уровень экспрессии гена АГЛ-синтазы был значительно выше, чем при культивировании бактерий на полноценных питательных средах. Уровень экспрессии определяли при помощи отработанной нами тестовой системы на основе ПЦР в реальном времени.

Высокий уровень транскрипции гена АГЛ-синтазы свидетельствовал об активации системы кворума P. аtrosepticum SCRI1043, что также подтверждалось более высоким уровнем АГЛ в супернатантах культур микроорганизма, инкубированных в присутствии растительных тканей, чем на полноценных питательных средах. Содержание АГЛ мы контролировали при помощи АГЛ-сенсорного штамма Escherichia coli JLD271, несущего репортерную плазмиду AL103 с генами люциферазной системы.

Особого внимание заслуживает то, что система кворума P. аtrosepticum SCRIактивировалась при культивировании бактерий в присутствии тканей специфичного растения-хозяина (картофеля) в большей степени, чем неспецифичного (табака).

Это позволяет считать, что система кворума P. аtrosepticum SCRI1043 интегрирована в глобальные сигнальные системы, ответственные за распознавание растения в качестве организма хозяина.

Дальнейшую характеристику растительных метаболитов, влияющих на синтез АГЛ P. аtrosepticum SCRI1043 проводили только на примере картофеля. Для этого была проведена постадийная очистка растительного экстракта (ультрафильтрация, осаждение растворителями, ионообменная хроматография, гель-хроматография). Благодаря этому было выявлено несколько фракций, которые обладали способностью индуцировать синтез АГЛ у P. аtrosepticum SCRI1043. Установлено, что целевые соединения растительной природы являются термостабильными, низкомолекуляными (молекулярная масса менее 1000 Да), заряженными, полярными. По нашему мнению их дальнейшая характеристика и идентификация позволят значительно расширить представления о растительных эрвиниозах при взаимодействии со специфичными и неспецифичными хозяевами.

Идентификация бактерий рода Bacillus, выделенных из различных экологических ниш с помощью секвенирования гена 16S рРНК Мынбаева Марьяна Жандосовна (Казахстан, Астана, maryana.81@mail.ru) Классификация бактерий, основанная на последовательности нуклеотидов 16S рРНК, позволяет на основании сравнения первичной структуры части гена 16S рРНК с известными структурами из GenBank или EMBL библиотек нуклеотидных последовательностей отнести исследуемые виды бактерий к различным таксономическим группам и видам. Ген 16S рРНК имеет как высококонсервативные, так и быстро эволюционирующие, вариабельные районы, исследование совокупности которых дает важную эволюционную информацию.

Исследование структуры гена рРНК позволяет не только установить или уточнить таксономическое положение штаммов, но и в иных ситуациях дает начало совершенно новым таксономическим группам. В последние годы особенно продуктивно этот метод используется для изучения биоразнообразия и филогенетических взаимоотношений внутри бактериальных сообществ.

Ген 16S рРНК содержит ~1550 п.н. Значительную часть гена занимают консервативные области, имеющие практически одинаковый нуклеотидный состав у различных микроорганизмов. Это позволяет подбирать универсальные праймеры для амплификации фрагментов гена различной длины.

Целью данной работы является подтверждение родовой принадлежности штаммов бацилл выделенных из различных экологических ниш, с помощью секвенирования гена 16S рРНК.

Объектом исследований были 50 штаммов B. subtilis, выделенные из почвы, растений, муки, хлебобулочных изделий, зерна пшеницы, которые сравнивали с коллекционными штаммами разных видов бактерий рода Bacillus.

Выделение ДНК проводили согласно стандартному протоколу описанному Vizert GenBank DNA Purification Kit (Promega, USA). Качественный анализ выделенной геномной ДНК учитывали с помощью электрофореза в агарозном геле. Количественный анализ выделенной геномной ДНК провели с помощью Thermo Scientific Nano Drop Spectrophotometer. Для определения нуклеотидной последовательности была поставлена ПЦР реакция с использованием праймеров: forward 8F и reverse 806R. Электрофоретический анализ проводили в 1% агарозном геле. После чего провели дефосфолирирование полученных ампликонов. Реакцию секвенирования провели с использованием BigDye® v 3.и forward праймера 8F. После проведения ПЦР-секвенирования исследуемые образцы загрузили в автоматический генетический анализатор 3730 xl DNA Analyzer для последующего разделения фрагментов методом капиллярного электрофореза. Полученную нуклеотидную последовательность сопоставляли с нуклеотидными последовательностями международных баз данных – GenBank.

В результате целевого поиска соответствий полученной нуклеотидной последовательности 16S rRNA с нуклеотидными последовательностями GenBank получены следующие результаты: 49 культур подтвердили свою родовую принадлежность к роду Bacillus, но видовое название не соответствует у двух штаммов. Таким образом, генотипирование подтвердило видовую принадлежность 47 культур – Bacillus subtilis, а две культуры принадлежали к Bacillus licheniformis. Автор выражает признательность к.б.н.

Ануарбековой С.С., д.б.н., профессору Алмагамбетову К.Х. за помощь в подготовке тезисов.

Определение мутагенной активности экстрактов содержимого кишечника Нагуманова Лилия Аслановна (Казахстан, Алматы, liilu2008@mail.ru) Нормальная микрофлора кишечника принимает участие в обезвреживании мутагенов путем их ферментативной инактивации, или за счет продукции антимутагенов. В результате микробной трансформации нормофлорой пищевых ингредиентов и ксенобиотиков, могут образовываться их мутагенные метаболиты. Эндогенное образование мутагенов и канцерогенов может осуществляться также и дисбиозной микрофлорой. Следует ожидать, что нарушение баланса микробов-симбионтов может привести к повышению содержания мутагенов в кишечнике, которое можно определить в генотоксикологических тестах.

Дисбактериозы кишечника, как правило, характеризуются снижением популяционного уровня бифидобактерий, лактобацилл и эшерихий. Содержание фекальных мутагенов при таких микроэкологических нарушениях практически не исследовалось. В связи с этим, цель настоящего исследования – определение мутагенной активности экстрактов фекалий при стандартном и сниженном популяционном уровне этих основных групп индигенной кишечной микрофлоры.

Мутагенный потенциал кишечных проб, взятых у 52 человек, определяли с помощью бактериальной тест-системы Эймса, состоящей из индикаторных штаммов Salmonella typhimurium ТА 98 и ТА 100. Предварительно в фекалиях пациентов бактериологическим методом был проанализирован качественный и количественный состав кишечного микробиоценоза. Данные микробных карт позволили разделить обследуемый контингент на две группы: первую (12 чел) без выраженных отклонений от принятого стандарта содержания основных представителей резидентной микрофлоры и вторую (40 чел) с выраженным снижением популяционного уровня бифидобактерий и лактобацилл.

В состоянии нормобиоценоза мутагенность была обнаружена только в 8,3% исследованных экстрактов. При дефиците бифидобактерий и лактобацилл (снижении популяционного уровня на 2 и более порядков) мутагенная активность обнаружена в 65% случаев.

Содержание мутагенов в этих фекальных экстрактах было в 4,8; 3,6 и 5,2 раза больше, чем в экстрактах их фекалий людей со стандартным популяционным уровнем бифидобактерий и лактобацилл. Связи между качественным и количественным составом эшерихиозной флоры и мутагенной активностью экстрактов фекалий не установлено. Ферментативные экстракты фекалазы, полученные из проб с высоким содержанием бифидобактерий и лактобацилл, снижали мутагенный эффект модельных мутагенов N-нитро-N-нитрозогуанидина и N-нитрозо-N-метилмочевины в 2 и 3,2 раза соответственно.

Таким образом, на эталонных штаммах Salmonella typhimurium системы Эймса показано, что снижение более чем на порядок стандартного количества бифидобактерий и лактобацилл в кишечнике приводит к повышению мутагенного фона в его содержимом.

Обнаружение и культивирование термофильных анаэробных представителей филогенетического типа Planctomycetes Непомнящая Яна Николаевна (Москва, yanann@rambler.ru) Представители филогенетического типа Planctomycetes представляют большую группу микроорганизмов и детектируются повсеместно в водных и наземных природных экосистемах с помощью молекулярных методов. В настоящее время в типе Planctomycetes условно выделяют три группы: (1) – культивируемые таксономически описанные микроорганизмы, (2) – некультивируемые микроорганизмы WPS-1 (самая обширная группа, включающая основное количество представителей типа Planctomycetes (GenBank)), (3) – отдаленная филогенетическая ветвь анаэробных аммоний-окисляющих бактерий, представители которых не были выделены в чистые культуры. Первая чистая культура планктомицет была получена в жидкой бедной органической среде в 1973 году.

На сегодняшний день в чистые культуры выделено и описано 12 видов и 10 родов типа Planctomycetes.

Pages:     | 1 |   ...   | 46 | 47 || 49 | 50 |   ...   | 85 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.