WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 23 | 24 || 26 | 27 |   ...   | 85 |

Тотальную РНК для ОТ-ПЦР выделяли из неоплодотворённых яйцеклеток и эмбрионов (стадии 2-х бластомеров, поздней бластулы, гаструлы, нейрулы и вылупления) шпорцевой лягушки Xenopus laevis. В качестве контроля экспрессии серотониновых рецепторов использовали головастиков и мозг взрослых лягушек. Показано, что экспрессия рецепторов 5–НТ3A и 5–НТ1A отсутствует на ранних стадиях эмбриогенеза и появляется с началом гаструляции. При этом экспрессия генов орнитиндекарбоксилазы и 1-адренорецептора, являющихся положительным контролем, была выявлена на всех исследованных стадиях развития. Таким образом, исследуемые рецепторы серотонина начинают экспрессироваться задолго до формирования нервной системы и могут участвовать в постгаструляционных процессах эмбриогенеза. Предыдущими исследованиями показано, что фармакологические характеристики медиаторных рецепторов на ранних стадиях эмбриогенеза существенно отличаются от таковых на поздних стадиях развития и у взрослых организмов, что дает основания предполагать и отличия их структуры. Отсутствие экспрессии исследованных нами рецепторов на догаструляционных стадиях говорит о том, что функции серотонина в раннем развитии могут опосредоваться другими рецепторами, возможно являющимися особыми эмбриональными формами. Дальнейшая работа будет посвящена изучению экспрессии серотониновых рецепторов в онтогенезе, в частности поиску их эмбриональных вариантов. Авторы выражают благодарность д.б.н. Ю.Б. Шмуклеру за помощь в подготовке тезисов. Работа поддержана грантом РФФИ № 08-04-00144.

Определение компонентов комплексов белка SUUR Drosophila melanogaster Посух Ольга Витальевна (Новосибирск, olga.posukh@gmail.com) Ген Suppressor of UnderReplication (SuUR) контролирует время завершения репликации и недорепликацию ДНК в гетерохроматиновых районах политенных хромосом D. melanogaster. Мутация в гене SuUR приводит к тому, что районы интеркалярного гетерохроматина и часть прицентромерного гетерохроматина заканчивают репликацию существенно раньше, чем в норме, и становятся полностью политенизированными.

Несмотря на большой объем данных об эффектах белка SUUR, механизм его участия в контроле репликации до сих пор остается невыясненным. Наша работа направлена на поиск белков-партнеров и изучение функциональных комплексов белка SUUR.

Нами был выбран метод двойной аффинной очистки (TAP – Tandem Affinity Purification), который позволяет выделять белковые комплексы в условиях наиболее близких к in vivo.

Работа по созданию такой системы для SUUR включала следующие этапы: (i) получение генетических конструкций, обеспечивающих экспрессию в организме дрозофилы белка SUUR и полипептида TAP в одной рамке считывания; (ii) получение линии культуры клеток дрозофилы S2, стабильно экспрессирущей белок SUUR-TAP; (iii) получение линий мух, экспрессирующих белок SUUR-TAP. Для проверки функциональности системы был проведен ряд тестов. Была продемонстрирована способность химерного белка SUUR-TAP восстанавливать фенотип дикого типа в мутантной линии мух и оказывать специфические эффекты на хромосомы в системе экспрессии GAL4-UAS. Полученный результат свидетельствует в пользу того, что химерный белок SUUR-TAP способен взаимодействовать с теми же белками-партнерами, что и эндогенный SUUR.

В результате фракционирования по размеру (FPLC) белковых комплексов из полученной линии культуры клеток и последующей детекцией белка SUUR-TAP было показано, что SUUR-TAP находится в составе крупных белковых комплексов (>440 кДа). Нами была проведена двойная аффинная очистка комплексов SUUR-TAP из белковых экстрактов полученной линии культуры клеток. Компоненты комплекса проанализировали при помощи масс-спектрометрии и выявили ряд белков – кандидатов в партнеры SUUR.

На следующем этапе работы предстоит проверка полученных взаимодействий генетическими методами. А также будет проведена двойная аффинная очистка комплексов белка SUUR-ТАР из эмбриональных экстрактов дрозофилы, так как наибольшее количество SUUR обнаружено именно в эмбрионах.

Оценка генетического полиморфизма генов биотрансформации алкоголя ADH1B, ALDH2 и CYP2E1 в популяциях коренного и пришлого населения Сибири Солопёкин Николай Валерьевич (Кемерово, nikolai_solopeki@mail.ru) Полиморфизмы ADH1B*2 возникают вследствие мутации G-A в 3 экзоне, приводящей к замене Arg47His; ALDH2*2 – G-A в 12 экзоне, которая приводит к замене Glu504Lys;

CYP2E1 – G-C в 5'-фланкирующем регионе. Целью исследования было изучение полиморфизмов данных генов в трех группах. У коренного малочисленного сибирского народа – шорцев, у пришлого русского населения Сибири и у потомков смешанных шорскорусских браков. Всего было обследовано 246 человек, проживающих в Таштагольском районе Кемеровской области. Генотипирование проводили методом ПЦР. Результаты оценивали при помощи электрофореза в агарозном геле. Для детекции использовали окраску гелей бромистым этидием с визуализацией на УФ-свете. На основе результатов генотипирования анализировали полиморфизм генов ADH1B*2, ALDH2*2 и CYP2E1, оценивали уровень генетического разнообразия в группах по методу М.Нея, рассчитывали генетические расстояния (d) между коренным, пришлым населением Сибири и потомками от смешанных браков. По результатам исследования показано, что генные локусы ADH1B и ALDH2 в группе шорцев (Ho=0.481 и Ho=0.518 соответственно) и потомков от смешанных браков (Ho=0.513 и Ho=0.566 соответственно) характеризуется высоким уровнем полиморфизма, CYP2E1 – средним уровнем (Ho=0.166 и Ho=0.231 соответственно). В группе исследованных пришлых русских Сибири полиморфизм генных локусов ADH1B и ALDHоказался высоким (Ho=0.520 и Ho=0.640 соответственно) и относительно низким у CYP2E(Ho=0.200). Значение показателя 2H-W свидетельствует о достоверном отклонении популяционных частот у шорцев от состояния равновесия по локусам ALDH2 и CYP2E(2H-W=9.563 и 5.785), однако направленность этого отклонения различна. В случае ALDHзарегистрирован избыток гетерозигот, а CYP2E1, наоборот, недостаток. Сравнение аллельных частот ADH1B, ALDH2 и CYP2E1 в трёх группах при помощи критерия выявило статистически значимые различия (p<0.001) при попарном сопоставлении русских с шорцами и с метисами. Полученная частота мутантных аллелей генов ADH1B, ALDH2 и CYP2E1 у шорцев (q=0.395; q=0.362; q=0.137 соответственно) значимо превышает частоту свойственную пришлым русским (q=0.042; q=0.015; q=0.017) и близка к частоте, отмеченной по данным литературы у азиатских народов. Генетические расстояния шорцами, русскими и метисами рассчитаные на основе аллельных частот генов ADH1B, ALDH2 и CYP2Eсвидетельствует о значительной дистанции пришлых русских от шорцев (d=0.111).

Сравнение значений средней удаленности от всех изученных групп показывает наименьшую удаленность от русских и шорцев группы метисов (d=0.034), которые, тем не менее, оказываются более близки шорцам (d=0.010). Работа поддержана государственным грантом РФФИ № 10-04-98082-p_сибирь_а «Оценка полиморфизма генетических систем биотрансформации алкоголя в популяции шорцев Кемеровской области».

Особенности генетического ответа клетки на суммарное действие экологических факторов – УФ-излучения и NO Стрельцова Дарья Александровна (Москва, dastr1@yandex.ru) Каждый организм в течение жизни подвергается воздействию многочисленных ДНКповреждающих агентов, представленных различными физическими и химическими факторами окружающей среды. В настоящее время все больший интерес приобретает проблема координации клеточного ответа на подобные повреждения. Кислород, оксид азота, ионизирующая и не ионизирующая радиация – являясь важнейшими элементами окружающей среды, также оказывают взаимное влияние на структуру и биологическую активность друг друга. Однако механизмы их комплексного воздействия на живую клетку до сих пор исследованы лишь фрагментарно. В наших предыдущих исследованиях впервые удалось показать, что адаптивный ответ или ранее развившийся SOS–процесс ингибируют в E.coli развитие >основного< SOS–репарационного ответа, если его индукторами являются химические мутагены.

В настоящей работе впервые проведено изучение модулирующего действия донора NO в отношении токсической и генотоксической активности УФ–излучения в условиях гипоксии.

Использован UVC–спектр УФ–излучения (=254 нм), генетическая активность которого не связана с формированием реактивных форм кислорода (ROS).

Нами было исследовано развитие SOS–репарационного ответа в штамме E.coli PQ[sfiA::lacZ] в условиях гипоксии – как реакции клетки на УФ–излучение (UVC), железосерные кристаллические доноры NO и комплексное воздействие двух SOS–индукторов при последовательной обработке культуры [UVCNO].

В работе впервые установлено разнонаправленное действие NO на токсическое действие УФ на клетку E.coli: 4–5–кратная сенсибилизация при гипоксии и 4,5–10–кратное протекторное действие в присутствии О2. При этом эффект сенсибилизации не проявлялся в штамме uvr+ с активной системой эксцизионной репарации УФ-повреждений UvrABC.

При изучении генотоксической активности нами выявлены значительные сенсибилизирующие свойства NO: показатели экспрессии гена sfiA в аэробных условиях, при последовательной обработке культуры [UVCNO] превышали уровни экспрессии, индуцированной UVC, в 3 раза; и уровни экспрессии, индуцированной NO – в 2,1 раза. Те же тенденции наблюдались в условиях гипоксии: экспрессия при последовательной обработке увеличивалась по отношению к UVC–индуцированной в 3,4 раза, а к индуцированной NO – в 1,6 раза.

Таким образом, нами впервые найдены сенсибилизирующие свойства NO в отношении токсического (в условиях гипоксии) и генотоксического (независимо от условий аэрации) действий УФ-излучения на живую клетку.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы РФФИ (грант №08-04-00228).

Автор считает приятным долгом поблагодарить за оказанное содействие, критическую оценку и обсуждение при выполнении работы Васильеву Светлану Васильевну.

Применение мультиплексной ПЦР для детекции Lr-генов пшеницы Суховеева Ольга Эдуардовна (Москва, olgasukhoveeva@gmail.com) Листовая (бурая) ржавчина – одно из опаснейших заболеваний мягкой пшеницы.

Ускорить создание устойчивых сортов помогает применение молекулярного маркирования в селекции (MAS). В нашем исследовании использовались STS-маркеры на гены устойчивости пшеницы к листовой ржавчине Lr19, Lr24 и Lr34.

При использовании STS-маркирования отсутствие у изучаемого образца на электрофоретическом геле бэнда может привести к ложным результатам из-за дилеммы между его неустойчивостью и отсутствием прохождения ПЦР. Целью нашей работы было ликвидировать этот недостаток, применив мультиплексную ПЦР с совместным использованием двух пар праймеров: на ген резистентности и на контрольный ген, бэнд которого при качественном прохождении реакции должен обязательно присутствовать на электрофоретическом геле.

В качестве контроля нами было предложено использовать ген тионина 1 типа. В работе применялась новая комбинация праймеров на этот ген. Варьирование температуры отжига от 54° до 64° и его временной продолжительности не оказывали влияния на высокий уровень совместной амплификации. Для получения равных количеств продуктов амплификации и бэндов одинаковой интенсивности в ПЦР смесь праймеры на гены резистентности (монокопийны в геноме) и на контрольный ген (имеет три копии) добавляли в соотношении 3:1. При совместной амплификации генов показана эффективность тест-системы при снижении концентрации ДНК до 3 нг/мкл.

Разработанная методика была апробирована на селекционном материале, предоставленном Краснодарским НИИСХ им. П.П. Лукьяненко. Результаты указывают на универсальность предлагаемой методики и возможность ее применения на других STSмаркерах. Работа выполнена при финасовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям РФ (государственный контракт 02.740.11.0286). Выражаю благодарность научному руководителю проекта к.б.н., руководителю Центра молекулярной биотехнологии Карлову Геннадию Ильичу.

Анализ экспрессии мобильных элементов группы gypsy у Drosophila melanogaster Урусов Феликс Анатольевич (Москва, flanger.fx@mail.ru) Мобильные генетические элементы (МГЭ) составляют значительную часть генома эукариот, играют важную роль в эволюции организмов. Однако неконтролируемые перемещения МГЭ могут быть причиной геномной нестабильности, которая выражается в повышении частоты мутаций, хромосомных перестроек и связанных с ними негативными последствиями для организма. В процессе эволюции в геноме организмов-хозяев (строго говоря, мгэ – это часть генома) появились механизмы, контролирущие перемещения МГЭ.

Так, у дрозофилы описан гетерохроматиновый локус flamenco, локализованный на Х-хромосоме, который ограничивает перемещения ретротранспозона gypsy предположительно путем РНК интерференции. В линиях, мутантных по flamenco, происходит активное перемещение gypsy. Кроме gypsy эффект flamenco распространяется на ретротранспозоны ZAM и Idefix. В геноме D. melanogaster, помимо ретротранспозонов gypsy, ZAM и Idefix, обнаружено еще 8 МГЭ, имеющих значительную гомологию с gypsy и потому отнесенных к группе gypsy. Не исключено, что flamenco может контролировать перемещения других МГЭ, входящих в группу gypsy. Нами была исследована экспрессия на уровне транскрипции 11 рэтроэлементов дрозофилы, входящих в состав группы gypsy: ZAM, 17.6, 297, Qasimodo, Idefix, Springer, Rover, Transpac, Tirant, Opus и gypsy. В настоящей работе использовались следующие линии D. melanogaster: 7К и 145 – изогенные линии, мутантные по flamenco (flam–), и линия 413 с нормальным аллелем flamenco (flam+). Экспрессия МГЭ исследовалась на разных стадиях развития: эмбриональной, личиночной и имаго. При этом на стадии имаго анализ проводился у самцов и самок отдельно. Существенных различий между двумя изогенными линиями 7К и 145 не было выявлено. Уровень транскрипции большинства анализируемых МГЭ в линиях с фенотипом flam– оказался повышенным по сравнению с уровнем транскрипции тех же МГЭ в 413 линии (flam+). По-видимому, транскрипция МГЭ группы gypsy подавляется нормальным аллелем flamenco. Кроме того, обнаружено, что эффект снижения количества транскриптов МГЭ сильнее выражен у самок 413 линии. На личиночной стадии транскрипция большинства ретротранспозонов не обнаруживается ни в одной из исследуемых линий. Это может быть связано с особенностями функционирования генома в целом на этой стадии развития. На эмбриональной стадии профиль экспрессии МГЭ существенно не отличается от стадии имаго.

Pages:     | 1 |   ...   | 23 | 24 || 26 | 27 |   ...   | 85 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.