WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 16 | 17 || 19 | 20 |   ...   | 85 |

В связи с вышесказанным интересным является использование в качестве таких веществ брассиностероидов – стероидных гормонов растений. В последнее время появились сведения об антипролиферативных и потенциально антиканцерогенных свойствах этой группы соединений на фоне низкой токсичности в отношении нормальных клеток.

Целью настоящей работы являлась оценка влияния брассиностероидов на индукцию ферментов CYP450 (в основном CYP1А1 и CYP1В1) в опухолевых клетках (на примере аденокарциномы молочной железы (линия MCF-7)). В качестве индуктора применяли 2,3,7,8-тетрахлородибензо-р-диоксин. В работе исследован ряд природных фитогормонов, различающихся строением стероидного скелета и боковой цепи (24-эпибрассинолид и 28-гомокастастерон) и синтетический стререоизомер 24-эпибрассинолида, особенность которого заключалась в S-конфигурации 22 и 23 атомов углерода, содержащих гидроксильные группы. Для количественной оценки степени индукции микросомальных ферментов при культивировании опухолевых клеток с брассиностероидами был рассчитан коэффициент эффективности, равный отношению максимальной скорости реакции к константе Михаэлиса. В качестве модельной использовали реакцию ферментативного окисления 7-этоксирезоруфина. Показано значительное влияние на индукцию (22S,23S)изомера природного 24-эпибрассинолида в то время действие естественных фитогормонов 24-эпибрассинолида и 28-гомокастастерона не выходит за пределы статистической ошибки.

В настоящей работе впервые установлено, что брассиностероиды снижают эффективность индукции ферментов CYP450 в опухолевых клетках, причем важное значение имеет структура как стероидного скелета, так и боковой цепи.

Рекомбинантная ДНК-метилтрансфераза M1.BspACI из Bacillus psychrodurans AC:

получение и биохимические свойства Тарасова М.В., Кузнецов В.В. (Новосибирск, tarasovamv@gmail.com) Сайт-специфичные ДНК-метилтрансферазы (метилазы) – это ферменты, катализирующие перенос метильной группы от донора, S-аденозил-L-метионина (SAM), на адениновое (N6mA-метилазы) или цитозиновое (С5mC- и N4mC-метилазы) основание в определенной последовательности ДНК. Как правило, метилазы вместе с эндонуклеазами рестрикции образуют системы рестрикции-модификации (RМ-системы). RM-системы, ферменты которых узнают несимметричные последовательности ДНК (тип IIS) включают как минимум две метилазы, каждая из которых модифицирует лишь одну из цепей ДНК. Ранее было показано, что константы Михаэлиса для ДНК, установленные для такого типа N6mAметилаз, как правило, существенно отличаются от KМ ДНК для N6mA-метилтрансфераз, узнающих симметричные нуклеотидные последовательности.

Ранее нами был обнаружен штамм Bacillus psychrodurans AC, содержащий RM-систему, рестриктаза которой узнаёт последовательность 5’-CCGC-3’. Целью работы было клонирование генов одной из метилаз данной RM-системы, получение рекомбинантного белка и сравнительный анализ его каталитических параметров относительно метилаз, узнающих палиндромные последовательности нуклеотидов. Для этого был клонирован фрагмент хромосомной ДНК B. psychrodurans AС, включающий, по даным анализа его нуклеотидной последовательности, гены двух С5mC-метилаз: M1.BspACI и M2.BspACI. Ген bspACIM1 был клонирован в составе вектора pJW2 и экспрессирован в клетках E.coli.

Препарат фермента M1.BspACI был получен путем очистки в пять хроматографических стадий. Были определены оптимальные условия работы рекомбинантного фермента:

максимальная его активность проявлялась при температуре 30°C и pH 8. Было установлено, что M1.BspACI модифицирует первый остаток цитозина в последовательности узнавания 5’-CCGC-3’. Определены кинетические параметры реакции метилирования ДНК ферментом M1.BspACI. Каталитическая константа оказалась равной 0,095±0,002 мин-1, KM ДНК – 0,053±0,007 мкМ, KM SAM – 5,1±0,3 мкМ.

Ранее в нашей лаборатории для N6mA-метилтрансфераз IIS типа было показано, что установленные для них KМ ДНК существенно выше KМ ДНК для N6mA-метилтрансфераз, узнающих симметричные нуклеотидные последовательности. По-видимому, это связано с различными механизмами реакции метилирования, катализируемой ферментами этих двух типов. Полученное нами значение KM ДНК M1.BspACI согласуется с этой закономерностью. Кроме того, мы показали, что каталитическая константа для метилаз IIS типа ниже, чем для метилаз с симметричными узнаваемыми последовательностями. Таким образом, в случае как N6mA-, так и С5mC-метилтрансфераз, ферменты, узнающие палиндромные сайты узнавания, проявляют большую активность и эффективнее связываются с ДНК, чем метилтрансферазы, модифицирующие непалиндромные последовательности ДНК.

Количественное определение протеолитических фрагментов белка IGFBP-4 — способ диагностики острого коронарного синдрома Трушина Юлия Александровна (Москва, yulijatryshina@gmail.com) Связывающий инсулиноподобный фактор роста белок 4 (IGFBP-4) является одним из представителей семейства IGF-связывающих белков. Согласно литературным данным, его функция состоит в регуляции взаимодействия инсулиноподобного фактора роста IGF с его рецептором. Для IGFBP-4 описана специфическая протеаза РАРР-А, которая расщепляет его в единственном месте – между аминокислотными остатками Met135 и Lys136, что приводит к диссоциации комплекса IGF-IGFBP-4 и взаимодействию первого с рецептором. На данный момент известны две изоформы РАРР-А, присутствующих в организме человека – гомодимерная активная форма РАРР-A и гетеротетрамерный комплекс РАРР-А и proMBP в соотношении 2:2, являющийся неактивной формой протеазы. Согласно литературным данным, присутствие димерной формы PAPP-A в атеросклеротических бляшках связано с процессом их дестабилизации. В связи с этим сделано предположение, что PAPP-A является маркером нестабильной атеросклеротической бляшки и что его клиническая оценка может играть чрезвычайно важную роль в идентификации не только нестабильных бляшек, но и в прогнозировании инфаркта миокарда. На сегодняшний день в литературе отсутствуют данные об исследовании ферментативной активности РАРР-А. Целью данной работы являлось создание системы, позволяющей судить об активности протеазы по продуктам ее реакции, а именно, высокочувствительной иммунологической системы, пригодной для количественного определения протеолитических фрагментов IGFBP-4 в биологических жидкостях с целью дальнейшего изучения ферментативной активности протеазы РАРР-А.

Для решения поставленной задачи идеально подходит широко распространенная иммунохимическая система «сэндвич»-типа. В такой системе используют пару антител, эпитопы которых являются пространственно удаленными участками молекулы. В результате инкубаций антител с антигеном образуется тройной иммунный комплекс с детекторной меткой, что позволяет количественно определить содержание антигена в образце.

Преимуществом этого метода является то, что он позволяет проводить количественные исследования непосредственно в биологических жидкостях с низким содержанием исследуемого белка.

В процессе работы получены 13 клонов гибридом, продуцирующих антитела, специфически узнающие протеолитические фрагменты белка IGFBP-4. Все они оказались специфичны на очень близкие участки молекулы, что делает практически невозможным их использование в иммуноферментной системе «сэндвич»-типа. Но используя коммерческие антитела в качестве антител подложки, специфичные к другим эпитопам, нам удалось создать флуороиммунную систему «сэндвич»-типа, которая была специфична в отношении протеолитических фрагментов белка IGFBP-4. Используя полученную пару, мы планируем детально изучить ферментативную активность РАРР-А. С помощью данных антител нами была показана потенциальная возможность создания флуороиммунной системы (пары антител), пригодной для количественного определения протеолитических фрагментов IGFBP-4 в биологических жидкостях.

Регуляция активности Са2+-АТФазы скелетной мускулатуры крыс в норме и в условиях экспериментальной острой высокой гипертермии Тумилович Александра Владимировна (Белоруссия, Минск, nimphaizozera@mail.ru) Высокая температура окружающей среды является неблагоприятным фактором, который часто действует на организм человека и животных, приводя к возникновению состояния гипертермии и нарушению функционирования различных органов и систем. Гипертермия сопровождается повышением и качественными нарушениями обмена веществ, потерей воды и солей, нарушением кровообращения и доставки кислорода к мозгу, вызывающими возбуждение, иногда судороги и обмороки. В то же время, искусственная гипертермия применяется при лечении некоторых нервных и вялотекущих хронических заболеваний, а также в комплексной радиотерапии опухолей.

Целью данной работы явилось изучение влияния куркумина и силимарина на активность Са2+-АТФазы скелетной мускулатуры крыс в норме и в условиях экспериментальной острой гипертермии. Постановка модели острой высокой гипертермии у крыс проводилась в соответствии с требованиями описанными Л.И Усай, 1990. Активность Са2+-АТФазы измерялась на изолированном препарате легкой фракции саркоплазматического ретикулума скелетной мускулатуры крыс по количеству неорганического фосфата, накопленному в среде инкубации и измеренному по методу Ратбуна и Бетлах. Содержание белка в мембранном препарате измерялась по методу Петерсона. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Stadia 6.0.

Установлено, что острая высокая гипертермия (42 С, 1 час) in vivo вызывает некоторое повышение активности Са2+-АТФазы скелетной мускулатуры крыс (9,4 % к контролю).

В этого же время наблюдается уменьшение величины Км с 8,5·10-4 моль/л, характерной для Са2+-АТФазы интактных крыс, до 3,5·10-4 моль/л у крыс, подвергшихся гипертермии. Это свидетельствует о том, что гипертермия увеличивает сродство Са2+-АТФазы к субстрату.

Установлено также, что острая высокая гипертермия не оказывает влияния на время полужизни фермента, которое соответствовало 17 минутам как в норме, так и в условиях гипертермии. Интересно, что силимарин не оказывает достоверного влияния на интактный фермент, но модифицирует активность Са2+-АТФазы крыс, подвергнутых гипертермии, достоверно активируя ее в концентрациях 10-10-10-8 моль/л и проявляя ингибирующий эффект в концентрациях 10-7-10-6 моль/л. В то же время куркумин не оказывает действия на Са2+-АТФазу как в норме, так и в условиях экспериментальной гипертермии во всем исследованном диапазоне концентраций (10-10-10-6 моль/л).

Таким образом, нами был изучено влияние острой высокой гипертермии на активность Са2+-АТФазы крыс, а также исследована возможность модифицирующего действия куркумина и силимарина.

Изменение экспрессии изоформ трансгелина при развитии рака простаты Уласова Наталья Юрьевна (Москва, ulasova_n@mail.ru) Клеточная подвижность – основная черта нормальных и патологических процессов.

Одним из важных признаков опухолевой трансформации клеток считают изменение цитоскелета. Именно изменения актиновых микрофиламентов непосредственно связывают со способностями раковых клеток к повышенной подвижности и метастазированию.

Рак простаты (РП) занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости в мире и второе место в структуре онкологической смертности у мужчин в промышленноразвитых странах, но и характеризуется бессимптомным течением болезни на ранних стадиях, а также отсутствием достоверного диагностического метода выявления этой патологии. Наиболее распространенным методом диагностики РП является определение уровня простат-специфичного антигена (ПСА) в сыворотке крови. Этот метод не является травматичным для пациента, однако его использование не дает 100% достоверных результатов, т.к. повышенный уровень ПСА в крови наблюдается также при доброкачественной гиперплазии, простатите, ишемии или инфаркте предстательной железы.

В связи с этим, актуальным является поиск новых молекулярных маркеров, которые способны не только различать разные виды опухолей простаты на ранних стадиях, но и применение которых будет как можно менее травматичным для пациента.

Многочисленные результаты, полученные другими авторами, подтверждают существенную роль актин-связывающих белков (АСБ) при развитии РП. Таким образом, существуют веские основания считать, что целый ряд АСБ может быть использован в качестве молекулярных маркеров РП на ранних стадиях, когда тканевые симптомы этого заболевания еще не сформировались.

В данной работе для выделения АСБ из гомогената ткани простаты был использован метод, предложенный Goode (2002). Исследуемые образцы ткани простаты последовательно центрифугировали при 17 тыс и 30 тыс оборотов, инициировали полимеризацию актина, а затем осаждали F-актин с ассоциированными актин-связывающими белками. 50 мкг полученного белка наносили на 11 см стрипы и проводили двумерный электрофорез.

Методом MALDI-TOF было идентифицировано 26 белков, из них 3 приходится на изоформы актина, 7 – на актин-связывающие белки, оставшееся количество – это белки, характерные для сыворотки и гликолитические ферменты. Сопоставление АСБ, выделенных из гомогенатов ткани простаты с раком IV степени и из ткани без патологий простаты, выявило различия в количестве такого АСБ, как трансгелин. Количество 3-х его изоформ (трансгелин, трансеглин 2, трансгелин 3) существенно увеличивается в гомогенате ткани простаты с IV степенью рака.

Изменение количества трансгелина при развитии онкологических процессов было показано для многих тканей организма. Увеличение выборки онкологических образцов позволит подтвердить возможность использования полученных данных в диагностике.

Pages:     | 1 |   ...   | 16 | 17 || 19 | 20 |   ...   | 85 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.