WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 15 | 16 || 18 | 19 |   ...   | 85 |

Нами было выделено и охарактеризовано новое семейство токсинов из яда среднеазиатского паука Agelena orientalis - /-агатоксинов, обладающих уникальным специфичным и комбинированным действием на натриевые каналы насекомых.

Тестирование активности токсинов проводили с помощью метода двухэлектродной фиксации потенциала на ооцитах Xenopus laevis, экспрессирующих гены субъединиц натриевого канала дрозофилы. В результате показано, что для /-агатоксинов характерна активность двух типов классических токсинов скорпионов: альфа-, препятствующих инактивации каналов, и бета-, облегчающих процесс их активации. /-Агатоксины состоят из 36-38 аминокислотных остатков, имеют четыре дисульфидные связи и С-концевое амидирование. Высокое сходство с -палутоксином IT2, для которого известна пространственная структура, позволило построить модель пространственной организации /-агатоксинов с помощью гомологичного моделирования и предположить возможные остатки, ответственные за связывание токсинов с каналом. Для дальнейших структурных и функциональных исследований был получен рекомбинантный /-агатоксин-1 – основной компонент яда A. orientalis. Наработку рекомбинантного токсина проводили в составе гибридного белка с тиоредоксином в клетках Escherichia coli. В результате селективного гидролиза гибридного белка и очистки целевой продукт был получен в индивидуальном виде, выход составил 2 мг токсина с 1 л бактериальной культуры.

Выявление антикоагулянтной активности у соединений на основе сульфатированной целлюлозы и исследование её связи с подвижностью их комплексов с сульфатом протамина в электрическом поле Савчик Елена Юрьевна (Москва, elena-savchik3@yandex.ru) Проблема тромбообразования – одна из важнейших терапевтических проблем в развитых странах. Тромбозы возникают в следствие действия нескольких патогенетических факторов, основной механизм образования артериального и венозного тромба связан с повышением свертываемости крови и стазом. Одними из лекарственных средств, используемых для борьбы с тромбозами, являются антикоагулянты: нефракционированный гепарин (НФГ), низкомолекулярный гепарин (НМГ), антагонисты витамина К. Однако эти вещества обладают рядом побочных эффектов, такими как: кровотечения, развитие тромбоцитопении, остеопороза и др. В связи с этим значимым и перспективным является поиск фармакологических средств для профилактики и лечения тромбозов на основе антикоагулянтов из ряда новых сульфатированных полисахаридов (ПС).

Получение, сульфатирование и анализ структуры образцов целлюлозы, выделенной из древесины осины, осуществляли в лаборатории каталитической химии угля и биомассы Института химии и химической технологии СО РАН (Красноярск). Были исследованы образцов сульфатированной целлюлозы с различной молекулярной массой (Mr, 12-19 kDa) и содержанием серы (S, 8,0-8,7%) на наличие антикоагулянтной активности (АК) и связи АК с подвижностью комплексов полисахаридов с поликатионом – сульфатом протамина в электрическом поле. Определяли антитромбиновую (aIIa) и анти-фактор Ха (аХа) активности, что означает способность ингибировать фибриногенсвертывающую или амидолитическую активности сериновых протеаз свертывающей системы крови – тромбина (фактор IIa) и фактора Ха, выраженную в единицах Международного стандарта НФГ.

Проводили биоспецифичный электрофорез комплексов полисахаридов с поликатионом протамина сульфатом (ПС) в слое агарозы. В результате электрофореза наблюдали пики преципитации комплексов полианион-поликатион.

Образцы полисахаридов показали практически одинаковую антитромбиновую (45,6±1,0 - 53,8±6,8 Е/мг) и анти-фактор Ха (8,6±1,8-10,5±2,0 Е/мг) активности, кроме одного образца с молекулярной массой 14 kDa и содержанием серы 8,1%. Данный полисахарид проявил наиболее низкую АК активность (аIIа=12,5±1,5 Е/мг, аХа=2,1±0,2 Е/мг). Размеры пиков преципитации (высота h и площадь S) значительно положительно коррелируют с аIIа и аХа активностями полисахаридов (raIIa-h=0,90-0,99; raXa-S=0,76-0,88). Значения аIIа и аХа умеренно положительно коррелируют с молекулярной массой полисахаридов (raIIa =0,37;

raXa =0,43) и содержанием серы в них (raIIa =0,44; raXa=0,25).

Таким образом, показано наличие связи между антикоагулянтной активностью соединений на основе сульфатированной целлюлозы и подвижностью их комплексов с сульфатом протамина в электрическом поле: чем выше АК активность образца, тем больше размеры его пиков преципитации, что может быть использовано для выявления наиболее активных полисахаридов. Выражаю особую благодарность моему научному руководителю Дрозд Наталье Николаевне, а также научным сотрудникам Института химии и химической технологии СО РАН (Красноярск) за предоставление образцов.

Глифосат-оксидоредуктаза — новый фермент первичной атаки органофосфонатов Свиридов Алексей Владимирович (Пущино, alhummen@rambler.ru) Органофосфонаты (ОФ) – класс соединений, имеющих в своей структуре прямую углерод-фосфорную (C-P) связь – широко применяются в качестве пестицидов и являются опасными загрязнителями окружающей среды. C-P связь устойчива к химическим и физическим факторам воздействия, однако расщепляется ферментами некоторых микроорганизмов (Кононова, Несмеянова, 2002; Rank et al., 1992; Ternan et al., 1998;

Torstensson, 1985; Veiga et al., 2001). Изучение таких ферментных систем имеет большое значение для разработки методов биоремедиации загрязненных почв и воды, а также промышленных стоков (Carson et al., 1997). Однако обнаружены лишь единичные ферменты деструкции ОФ, причем механизм их действия, физико-химические и кинетические характеристики, за редким исключением, не изучены (Кононова, Несмеянова, 2002; Barry, Kishore, 1998; Obojska et al., 2002).

Нами впервые был выделен и охарактеризован новый ключевой фермент деструкции органофосфонатов у бактерий – глифосат-оксидоредуктаза, превращающий гербицид глифосат (N-фосфонометилглицин) и некоторые другие ОФ в нетоксичные соединения (Barry, Kishore, 1998; Carson et al., 1997; Obojska et al., 2002). Разработана схема очистки фермента до электрофоретически гомогенного состояния, обеспечивающая выход не менее 65%. У глифосат-оксидоредуктазы были определены основные физико-химические (ММ, изоэлектрическая точка, температурный и pH-оптимумы, термостабильность) и кинетические (Кm, Vmax) характеристики, исследованы субъединичный состав и влияние ионов металлов на активность фермента, обнаружены кофакторы, необходимые для катализа, найдены способы сохранения активности фермента при длительном хранении.

Проведенный MALDI-TOF анализ глифосат-оксидоредуктазы показал высокую гомологию с семейством FAD-содержащих монооксигеназ (саркозиноксидаза, D-лизиноксидаза и др.).

Механизм полиспецифичности иммуноглобулинов молока человека Седых Сергей Евгеньевич (Новосибирск, sirozha@gmail.com) Гипотеза конформационной пластичности антиген-связывающих участков антител является одним из общепринятых путей объяснения феномена полиспецифичности у иммуноглобулинов. Активные центры молекул моноклональных антител под действием некоторых из связываемых лигандов, могут эффективно изменять конформацию антигенсвязывающего домена, подстраиваясь под структуру связываемого лиганда. Описанный механизм полиспецифичности иммуноглобулинов, несомненно, существует и может объяснить неспецифическое связывание моноклональных и природных антител с самыми разными близкородственными лигандами.

В данной работе была впервые исследована полиспецифичность каталитически активных антител (абзимов). Электрофоретически гомогенные IgG и sIgA молока человека были разделены аффинной хроматографией по сродству к ДНК. Все полученные фракции IgG и sIgA обладали каталитическими активностями в реакциях гидролиза ДНК, АТР, олигосахарида, а также фосфорилирования липидов и олигосахаридов, прочно связанных с антителами. Аналогичная ситуация наблюдалась при последующей хроматографии sIgA и IgG, имеющих сродство к ДНК, на АТР-сефарозе. При этом наблюдалось полное или частичное перекрывание пиков, соответствующих различным исследованным активностям.

Высокое сродство некоторых субфракций IgG и sIgA к аффинным сорбентам, обладающих несколькими каталитическими активностями может указывать на то, что молекулы sIgA и IgG могут содержать антигенсвязывающие центры к различным антигенам.

Таким образом, возможным механизмом происхождения каталитической полиспецифичности абзимов молока человека, может быть обмен “плечами” их Fab, доказанный ранее для IgG четвертого подкласса крови человека, легкими цепями или, в случае sIgA, образования химерных молекул из мономеров IgA с различными активными центрами. Работа поддержана грантами РФФИ № 07-04-00387, 09-04-00804, Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» № 21.16, Аналитической ведомственной целевой программой «Развитие научного потенциала высшей школы» 2.1.1/5580.

Фосфорилирование тау белка человека по трём остаткам серина влияет на его взаимодействие с белком 14-3-Случанко Николай Николаевич (Москва, nns@live.ru) Тау белок, специфичный для нервной ткани, принадлежит к группе белков, ассоциированных с микротрубочками, и регулирует формирование, динамику и функционирование системы микротрубочек нейронов. По данным литературы точечные мутации, ограниченный протеолиз, окисление SH-групп, а также гиперфосфорилирование тау белка могут приводить к накоплению парно-скрученных филаментов – характерного признака целого ряда нейродегенеративных заболеваний, так называемых таупатий, в частности, болезни Альцгеймера. Было показано, что универсальный адапторный белок 14-3-3 совместно локализуется с агрегатами тау, и было высказано предположение о том, что 14-3-3 может каким-то образом влиять на образование таких агрегатов. В данной работе было решено исследовать эффект фосфорилирования тау белка на его взаимодействие с 14-3-3.

Методами нативного электрофореза, гель-фильтрации и химического сшивания мы показали, что фосфорилирование короткой изоформы тау белка человека под действием протеинкиназы А (ПКА) значительно усиливает взаимодействие тау с рекомбинантным 14-3-3. Было предположено, что за этот эффект отвечает остаток Ser156 короткой изоформы (или Ser214 длинной изоформы) тау белка человека, расположенный в консенсусной последовательности, узнаваемой 14-3-3. Однако мутация S156A, блокирующая фосфорилирование тау по данному остатку серина, уменьшала, но не полностью отменяла взаимодействие фосфорилированного тау с 14-3-3. Таким образом, мы предположили наличие в молекуле тау других остатков серина, фосфорилируемых ПКА и ответственных за прочное связывание тау с 14-3-3. С помощью метода точечного мутагенеза мы показали, что, по крайней мере, три остатка серина (Ser156, Ser235 и Ser267) короткой изоформы тау играют важную роль во взаимодействии тау с 14-3-3. Таким образом, участки связывания 14-3-3, фосфорилируемые ПКА, находятся в Pro-богатом (Ser156) и тубулин-связывающем (Ser235 и Ser267) доменах тау белка человека. Работа была поддержана грантом РФФИ.

Цитотоксическое действие производных секоизоларицирезинола диглюкозида из семян льна масличного Стасевич Ольга Викторовна (Белоруссия, Минск, ostas83@mail.ru) Секоизоларицирезинола диглюкозид (СДГ) – фенилпропаноид, относящийся к классу лигнанов. Содержание СДГ в семенах льна масличного достигает 3% в расчёте на обезжиренное сырьё (Johnsson et al., 2000). Это соединение обладает широким спектром биологической активности. Цель данной работы – выделение СДГ из семян льна масличного, получение его производных и исследование цитотоксических свойств полученных соединений. Лигнан СДГ был выделен из семян льна масличного с чистотой 95,3%. Далее было получено его производное, в котором отсутствовала глюкозидная часть (секоизоларицирезинол), а также диацетильное производное по фенольным гидроксилам (секоизоларицирезинол-4',4''-диацетат). Структуры полученных веществ были подтверждены на основании данных ИК-, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.

Цитотоксичность изучаемых соединений в концентрациях 11.6, 23.3, 58, 145, 290, мкМ оценивали с помощью МТТ теста (Mosmann, 1983) относительно В-лимфобластоидной клеточной линии Raji. В качестве стандартного цитотоксического средства использовали противоопухолевый препарат этопозид. Лигнан СДГ не проявлял цитотоксического действия по отношению к клеточной линии Raji при концентрации менее 580 мкМ, в то время как его производные обладали антипролиферативным действием. При этом цитотоксический эффект секоизоларицирезинол-4',4''-диацетата (IC50 = 135±2,4 мкM) был выше секоизоларицирезинола (IC50 = 143±3,5 мкM). Этопозид проявлял себя как наиболее сильный цитостатик (IC50 < 11,6 мкM).

Цитотоксическую активность по индукции апопотоза для производных СДГ и этопозида относительно той же клеточной линии также оценивали методом проточной цитофлуориметрии. Уровень индукции апоптоза определяли по снижению трансмембранного потенциала митохондрий (детектировался по уровню флуоресценции зонда CMXros) и морфологическим изменениям клеток – уменьшением их в размере, повышением их грануляции. Регистрацию количества апоптотических клеток производили после инкубации с соединениями в концентрациях 58; 145; 290; 580 мкМ в течение 24ч и 48ч. Производные секоизоларицирезинол и секоизоларицирезинол-4',4''-диацетат обуславливали индукцию апоптоза в данном диапазоне концентраций, сопоставимую с действием этопозида. Повышение цитотоксической активности у лигнанов в связи с удалением глюкозидной части и ацетилированием фенольных гидроксилов можно объяснить снижением гидрофильности молекулы, что способствует её большему проникновению через мембрану клетки. Выражаю благодарность к.б.н. Т.В. Шман.

Оценка влияния брассиностероидов на индукцию монооксигеназ в опухолевых клетках Сыса Алексей Григорьевич (Белоруссия, Минск, aliaksei.sysa@gmail.com) Одним из широко распространенных путей метаболических превращений в организме человека и животных различных по структуре веществ являются окислительные процессы, катализируемые монооксигеназной системой. Ключевыми компонентами монооксигеназных систем являются ферменты суперсемейства цитохромов P450 (CYP450), обладающие широкой субстратной специфичностью. В настоящее время не вызывает сомнений, что уровень экспрессии и спектр каталитической активности некоторых изоэнзимов CYP450 в значительной степени определяет возможность возникновения и развития канцерогенеза.

В частности, показана повышенная экспрессия CYP1A1 и CYP1B1 в опухолях.

Потенциальная роль CYP1A1 и CYP1B1 в мутагенезе делает перспективным поиск специфических ингибиторов CYP1A1 и CYP1B1 как возможных антиопухолевых агентов.

Pages:     | 1 |   ...   | 15 | 16 || 18 | 19 |   ...   | 85 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.