WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 14 | 15 || 17 | 18 |   ...   | 85 |

Химиотерапестические препараты, применяемые в настоящее время для терапии опухолевых заболеваний, имеют ряд существенных недостатков, связанных с высокой токсичностью и устойчивостью многих опухолей к терапии. В связи с этим весьма актуальна задача поиска новых соединений с противоопухолевой активностью.

В ходе данного исследования исследовались цитотоксические свойства ряда производных 2-оксазолидона. Исследуемые содединения включали 4,4-дигидроксиметил-2-окзазолидон и его производные, содержащие морфолин или пиперидин. Все соединения были синтезированы в лаборатории органического синтеза ИПХФ РАН (А.Г. Корепин, Н.М.

Глушакова).

Влияние производных триазола на клетки HeLa (аденокарцинома шейки матки человека) исследовали с помощью МТТ-теста и проточной цитофлуориметрии после окрашивания йодистым пропидием. Клетки обрабатывали исследуемыми соединениями, и через 24 ч окрашивали красителем МТТ. Из данных «доза-эффект» получали значения IC50.

Обнаружено, что соединения, содержащие морфолин или пиперидин, проявляют цитотоксическую активность в концентрации 100-150 мкМ. Сам 4,4-дигидроксиметил-2окзазолидон не проявляет цитотоксичности в концентрациях до 500 мкМ. Морфолин в концентрации 150 мкМ также не влияет на клетки. Таким образом, цитотоксичность соединений не обусловлена их структурными составляющими, а проявляется только при условии присутствия в соединении как 4,4-дигидроксиметил-2-окзазолидона, так и второго циклического компонента. Для исследования влияния на клеточный цикл клетки обрабатывали цитотоксическими производными 2-окзазолидона в дозах IC50 в течение 24 ч, а затем клетки фиксировали и ДНК в них окрашивали йодистым пропидием. Интенсивность окрашивания клеток измеряли с помощью проточной цитофлуориметрии. Обнаружено, что производные 2-окзазолидона в дозе IC50 проявляют цитостатическую активность, снижая количество клеток в фазе G2/M и увеличивая количество клеток, находящихся в фазе G1/Gклеточного цикла. Соединение, содержащее пиперидин, проявляет также слабый цитоцидный эффект, вызывая накопление клеток в sub-G1 области.

Мы благодарим с.н.с. лаборатории молекулярной биологии ИПХФ РАН Г.В. Костюк за помощь в проведении экспериментов по изучению цитотоксичности, доцента кафедры биохимии биологического факультета ННГУ А.А. Брилкину и зав. лаб. клеточных технологий кафедры биофизики биологического факультета ННГУ И.В. Балалаеву за помощь в проведении проточной цитофлуориметрии и научного руководителя – зав. лаб.

молекулярной биологии ИПХФ РАН А.А. Терентьева.

Анализ сигнальных каскадов, зависимых от NADPH-оксидазы и стимулирующих миграцию и пролиферацию клеток под действием факторов роста Морозов Я.И., Тюрин-Кузьмин П.А. (Москва, morozov.ji@mail.ru) Активация тирозинкиназных рецепторов (RTK) под действием факторов роста стимулирует миграцию и пролиферацию клеток за счет внутриклеточных сигнальных путей, основными из которых являются МАР-киназные и PI3-киназный каскады. Однако роль других сигнальных молекул остается во многом неясной. Мы обнаружили, что НАДФНоксидазный комплекс (NOX) вносит важный вклад в пролиферативный ответ клеток HeLa на эпидермальный фактор роста (EGF), который блокируется при нарушении сборки NOX под действием апоцинина. Аналогично, апоцинин подавлял миграционный ответ 3Тфибробластов на тромбоцитарный фактор роста (PDGF). Используя внутриклеточный биосенсор к перекиси водорода (H2O2), мы установили, что стимуляция клеток ростовыми факторами приводит к активации NOX и повышению уровня H2O2 в цитоплазме. Апоцинин блокировал как EGF-, так и PDGF-зависимое накопление H2O2 в клетках, указывая на то, что NOX и H2O2 вносят важный вклад в стимуляцию миграции и деления клеток.

Мы исследовали участие Erk-МАР-киназного и PI3-киназного каскадов в PDGFзависимой миграции 3Т3 фибробластов в зону повреждения клеточного монослоя путем прижизненной микроскопии и ингибиторного анализа. Ингибитор PI3-киназы существенно тормозил миграцию, тогда как ингибитор Erk-МАР-киназ не влиял на скорость миграции клеток в рану. Эти результаты свидетельствуют о ведущем вкладе PI3-киназного, но не МАР-киназного, каскада в миграционный ответ клеток к факторам роста.

Далее мы исследовали взаимосвязь между активацией NOX и образованием H2O2 в клетках, с одной стороны, и профилем активации сигнальных каскадов под действием факторов роста, с другой. Мы обнаружили двуфазный характер активации Erk-МАР-киназ в клетках HeLa при их стимуляции EGF, и в 3Т3 фибробластах при воздействии PDGF.

За первой фазой быстрой активации МАР-киназ в течение 5-10 мин следовала стадия уменьшения активности с появлением последующей фазы повторного увеличения активности через 30-40 мин после стимуляции клеток. Ингибирование NOX апоцинином не приводило к изменению профиля активации Erk-МАР-киназ в фибробластах, что хорошо согласуется с отсутствем эффекта ингибирования Erk-МАР-киназ на миграцию этих клеток.

Ингибирование NOX в клетках HeLa вызывало увеличение первой фазы, но не изменяло второй фазы активации Erk-МАР-киназ. Эти результаты означают, что подавление активности NOX практически не отражается на длительности проведения сигнала через Erk-МАР-киназный каскад. В настоящее время мы исследуем влияние ингибиторов NOX на профиль активации РI3-киназного каскада.

В совокупности, мы показали, что NOX играет важную роль в стимуляции миграции и пролиферации клеток в ответ на активацию РТК факторами роста. Эффекты NOX не связаны с нарушением проведения сигнала через Erk-МАР-киназный каскад, но опосредованы активацией PI3-киназного каскада в случае миграционного ответа.

Мономеры участвуют в образовании гетероолигомеров малых белков теплового шока человека Мымриков Евгений Викторович (Москва, evgenem@mail.ru) Малые белки теплового шока (sHsp) – семейство ATP-независимых шаперонов. Геном человека кодирует 10 sHsp, некоторые из них тканеспецифичны (A-кристаллин, cvHsp, ODFP), а другие (В-кристаллин, Hsp27, Hsp20, Hsp22) экспрессируются повсеместно. Эти белки способны предотвращать агрегацию денатурированных белков, образующихся при неблагоприятных воздействиях, повышая выживаемость клеток при стрессе. sHsp формируют крупные гомоолигомеры, а также взаимодействуют между собой с образованием гетероолигомеров. Методы коиммунопреципитации, двойной гибридизации и FRET, применявшиеся ранее для исследования взаимодействия sHsp человека, не позволяют определить прочность, стехиометрию и молекулярный механизм образования гетероолигомеров. В данной работе мы применили новые подходы, позволяющие более подробно исследовать взаимодействие разных малых белков теплового шока.

Для решения поставленной задачи мы использовали рекомбинантные B-кристаллин, Hsp27, Hsp20 и Hsp22 дикого типа, а также их точечные («цистеиновые») мутанты, содержащие единственный остаток цистеина в участке (7-складка -кристаллинового домена), ответственном за образование гомодимеров sHsp. Ранее мы установили, что внесение точечных мутаций (замена остатков цистеина на серин и введение одного остатка цистеина в 7-складку) не влияет на структуру и шаперонную активность исследуемых белков. «Цистеиновые» мутанты B-кристаллина, Hsp20 и Hsp22, так же как Hsp27 дикого типа, при мягком окислении образуют гомодимеры, связанные дисульфидным мостиком.

Для анализа способности этих белков образовывать гетеродимеры образцы, содержащие два разных белка, инкубировали 1 час при 42°С для обмена субъединицами и проводили окисление. При этом наблюдалось образование «сшитых» дисульфидной связью гомо- и гетеродимеров, однако, если одним из партнеров был Hsp22, доля гетеродимеров была незначительной. Данные, полученные с использованием «цистеиновых» мутантов, согласуются с результатами гель-фильтрации смесей различных sHsp дикого типа.

Установлено, что B-кристаллин, Hsp27 и Hsp20 дикого типа эффективно взаимодействуют между собой с образованием гетероолигомеров. В то же время, Hsp22 дикого типа не образует гетероолигомеры с исследуемыми sHsp. Используя «цистеиновые» мутанты sHsp, мы попытались ответить на вопрос, каким образом происходит формирование гетероолигомерных комплексов. В первой серии опытов происходил обмен свободными мономерами sHsp, и мы наблюдали образование гетероолигомеров, а во второй, когда смешивали «сшитые» дисульфидной связью димеры различных sHsp, образование гетероолигомеров не происходило. Таким образом, обмен субъединицами Hsp27, B-кристаллина и Hsp20 осуществляется преимущественно на уровне мономеров, а обмен более крупными блоками (димерами) затруднен. Стабилизация как гомо-, так и гетероолигомеров малых белков теплового шока осуществляется с участием 7-складки кристаллинового домена. Работа поддержана грантом РФФИ № 04-10-00026-а.

Октарфин как инструмент исследования неопиодного рецептора бэта-эндорфина Некрасова Ю.Н., Садовников В.Б., Наволоцкая Е.В. (Пущино, nekr-jul@mail.ru) Известно, что действие -эндорфина осуществляется через мю и дельта опиоидные рецепторы. В 1979 году Хейзум с соавт. впервые описал неопиоидные (нечувствительные к опиоидному антагонисту налоксону) рецепторы -эндорфина. До настоящего времени структура и функции последних остаются малоизученными. В 1980 г. Джулиард и соавт.

обнаружили в составе тяжелой цепи IgG человека -эндорфинподобную последовательность.

Затем Хоук и соавт. синтезировали тетрадекапептид SLTCLVKGFYPSDI, соответствующий -эндорфинподобной последовательности IgG (фрагмент 364–377 CH3 домена тяжелой цепи) и показали, что он конкурирует с меченным -эндорфином за связывание с мембранами головного мозга крысы. Позднее нами был синтезирован и исследован -эндорфинподобный декапептид SLTCLVKGFY (авторское название – иммунорфин), соответствующий последовательности 364-373 тяжелой цепи IgG человека. Эксперименты показали, что меченный тритием иммунорфин с высоким сродством и специфичностью связывается с неопиоидным рецептором -эндорфина T-лимфоцитов человека, перитонеальных макрофагов мыши, синаптических мембран головного мозга крысы, а также клеток человеческой T-лимфобластной линии Jurkat. Недавно нами был определен фрагмент -эндорфина наименьшей длины, способного с высоким сродством связываться с неопиоидным рецептором. Им является фрагмент молекулы гормона 12-19. Был синтезирован пептид TPLVTLFK, соответствующий последовательности 12-19 -эндорфина (авторское название октарфин).

Цель настоящей работы – изучение влияния октарфина на активность иммунокомпетентных клеток мыши in vitro и in vivo.

Получен меченный тритием октарфин (удельная активность 28 Ки/моль) и изучено его связывание с перитонеальными макрофагами мыши. Установлено, что меченный тритием октарфин связывается с макрофагами с высокой аффинностью (Kd 2,3±0,2 нМ) и специфичностью. Специфическое связывание меченнного тритием октарфина с макрофагами ингибировали немеченые -эндорфин и селективный агонист неопиоидного рецептора -эндорфина синтетический пептид иммунорфин (SLTCLVKGFY) (Ki 2,7±0,2 и 2,4±0,2 нМ соответственно) и не ингибировали немеченые налоксон, -эндорфин, -эндорфин и [Met5]энкефалин (Ki>10 мкМ). Показано, что октарфин стимулирует активность иммунокомпетентных клеток мыши in vitro и in vivo: при концентрации 1-10 нМ он увеличивал адгезию и распластывание перитонеальных макрофагов, а также их способность переваривать бактерии вирулентного штамма Salmonella typhimurium in vitro; внутрибрюшинное введение пептида (20 мкг/животное за 7, 3 и 1 сутки до выделения клеток) приводило к возрастанию активности перитонеальных макрофагов, а также T- и В-лимфоцитов селезенки.

Новый белок-ингибитор сериновых протеиназ из клубней картофеля Парфенов Игорь Александрович (Москва, triptofan99@gmail.com) В процессе эволюции растения выработали ряд защитных механизмов от действия фитофагов и фитопатогенов. Важной составляющей защитной системы являются вещества полипептидной природы. В их число входят белковые ингибиторы протеиназ типа Кунитца, подавляющие активность протеолитических ферментов патогенных бактерий и грибов, а также пищеварительных ферментов насекомых. Представители семейства пасленовых (Solanaceae) относятся к видам, обладающим значительным содержанием ингибиторов протеиназ и, особенно, в клубнях картофеля, где на их долю приходится до 20% всех водорастворимых белков. Среди этих ингибиторов обнаружены белки с молекулярными массами от 20 до 24 кДа. На основании особенностей первичной структуры эти белки были выделены в подсемейство, обозначенное как PKPIs (potato Kunitz-type proteinase inhibitors), входящее в состав суперсемейства соевого ингибитора трипсина типа Кунитца. Изучение их строения и особенностей функционирования является важным для понимания механизмов устойчивости растений к вредителям.

В рамках данной работы из клубней картофеля (Solanum tuberosum L., сорт Юбилей Жукова), возделываемого в Московской области и являющегося устойчивым к вирусным заболеваниям, был выделен белок-ингибитор сериновых протеиназ c молекулярной массой 23 кДа. Выделение и очистку белка проводили осаждением сульфатом аммония, гельхроматографией на сефадексе G-75 и ионообменной хроматографией на КМ-сефарозе CL-6B. Выделенный и очищенный белок массой 23 кДа эффективно подавлял активность трипсина и химотрипсина, образуя комплексы ингибитор: фермент, в соотношении 1:1, но слабее действовал на бактериальную протеиназу, субтилизин Карлсберг.

Изучено влияние данного гомогенного белка-ингибитора 23 кДа на рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов Fusarium culmorum и Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. При возрастающих концентрациях ингибитора наблюдали угнетение прорастания гиф и увеличение количества непроросших макроконидий гриба F. culmorum. Белок также подавлял рост мицелия оомицета Ph. infestans и вызывал лизис его зооспор.

Автор выражает признательность профессору, д.б.н. Т.А. Валуевой, и к.б.н. Т.А. Ревиной за помощь в работе и подготовке тезисов.

Исследование новых модуляторов потенциал-зависимых натриевых каналов /-агатоксинов из яда паука Agelena orientalis Прокудин Алексей Александрович (Москва, trashforyou@mail.ru) Потенциал-зависимые натриевые каналы - интегральные мембранные белки, характерные для электровозбудимых клеток. Главная функция этих белков состоит в обеспечении проведения нервных импульсов, поэтому неудивительно, что они являются одной из мишеней биологически активных веществ, используемых человечеством. Так, прогресс в создании новых анальгетиков и пестицидов во многом определяется поиском веществ, селективно воздействующих на натриевые каналы. При этом наиболее эффективными инструментами исследования этих белков являются природные токсины.

Pages:     | 1 |   ...   | 14 | 15 || 17 | 18 |   ...   | 85 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.