WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 12 | 13 || 15 | 16 |   ...   | 85 |

Нами было изучено влияние кверцетина, гесперетина, эпикатехина – структурно близких, но отличающихся степенью окисленности флавоноидов – на интенсивность перекисного окисления лецитина. Установлено, что при индукции ПОЛ системой Фентона флавоноиды в диапазоне концентраций 0,1-100 мкМ проявляют прооксидантные свойства. Наиболее эффективно кверцетин проявляет прооксидантную активность в концентрации 0,5 мкМ, гесперетин – 0,1 мкМ, эпикатехин – 1 мкМ. При индукции перекисного окисления липидов Fe2+ кверцетин ингибирует накопление ТБК-активных продуктов. В тех же условиях гесперетин проявляет антиоксидантные свойства в концентрации 1 мкМ, а в более высоких концентрациях оказывает прооксидантное действие. Эпикатехин обладает прооксидантной активностью в данной системе индукции ПОЛ в концентрациях больших 50 мкМ.При изучении влияния фдавоноидов на процесс пероксидазного окисления 3,3’,5,5’тетраметилбензидина (ТМБД) было установлено, что кверцетин и эпикатехин проявляют антиоксидантое действие и приводят к снижению начальной скорости реакции, а гесперетин не проявляет ни антиоксидантной, ни проокисдантной активностей. При изучении возможности пероксидазного окисления кверцетина, эпикатехина и гесперетина было установлено, что только первые два являются субстратами для пероксидазы. Итак, в описанных выше модельных системах исследованные флавоноиды проявляют как антиоксидантное, так и прооксидантное действие, причём особенности их действия зависит от структуры и концентрации в реакционной смеси.

Влияние митохондриально-направленных антиоксидантов на окислительный стресс и гибель клеток животных в культуре Долудин Юрий Валерьевич (Москва, stryider@rambler.ru) В настоящее время является общепризнанным мнение о том, что митохондрии в клетке являются основными источниками активных форм кислорода (АФК). В норме в результате функционирования защитных антиоксидантных систем клетки продукция АФК поддерживается на определенном, невысоком уровне. Повышенная продукция АФК приводит к развитию окислительного стресса и гибели клеток. В нашей лаборатории были разработаны митохондриально-направленные антиоксиданты, названные SkQ, состоящие из проникающего катиона (трифенилфосфония), коньюгированного с пластохиноном. Так же был синтезирован флуоресцентный аналог антиоксиданта, названный SkQR1, где в качестве проникающего катиона использовали родамин 19.

Нами были проведены серии опытов по исследованию динамики накопления SkQR1 в культурах опухолевых клеток HeLa, подкожных фибробластов человека и мезенхимальных мультипотентных стромальных клетках (ММСК). По нашим данным, накопление антиоксидантов в митохондриях происходило в течение двух часов. Повышение времени инкубации клеток в присутствии антиоксидантов не вызывало увеличение накопления SkQR1. Отмывка клеток от антиоксидантов приводила к выходу SkQR1 из митохондрий.

Добавление разобщителя мембранного потенциала митохондрий FCCP препятствовало накоплению антиоксидантов и способствовало более быстрому выходу SkQR1 из митохондрий после отмывки. В литературе было описано явление, получившее название множественной лекарственной устойчивости (МЛУ), представляющей собой процесс активного неспецифического откачивания гидрофобных молекул из клетки в результате активности транспортного белка Р-гликопротеина. Нами было обнаружено, что ингибирование МЛУ приводило к незначительному увеличению накопления SkQR1 в клетках фибробластов и ММСК, в то время как в культурах опухолевых клеток наблюдалось почти двукратное увеличение накопления антиоксидантов.

Нами были проведены эксперименты по исследованию защитного действия SkQ в условиях окислительного стресса, вызванного пероксидом водорода, на культурах клеток HeLa и фибробластов. Было обнаружено, что двухчасовая преинкубация клеток с антиоксидантами в наномолярной концентрации не способствует снижению уровня продукции АФК в митохондриях и защите клеток от гибели. Для достижения защитного эффекта SkQ требовалось более длительное время преинкубации, и для фибробластов оно составляло сутки. Для опухолевых клеток HeLa требовалась недельная преинкубация.

Получение 3-гидроксипроизводных ненасыщенных жирных кислот, их действие на биохимические процессы грибов Дородникова Елена Александровна (Москва, lenchik88878@mail.ru) Продукты окисления природных полиненасыщенных жирных кислот играют важную биологическую роль в процессах роста и размножения грибов и являются сигнальными соединениями в отношениях хозяин-патоген. Поэтому изучение механизма действия оксилипинов в жизненно важных процессах развития грибов, в частности, процессах адаптации и внешнего стресса, является актуальным. Ранее были опубликованы исследования, показавшие важную роль 3-гидрокси-эйкозатетраеновой кислоты (3-НЕТЕ) в сигнальных ответах грибов. Целью нашей работы было изучение действия 3-НЕТЕ, добавленной к культуре в разных концентрациях, на рост, дифференцировку и жизненные характеристики аскомицета Neurospora crassa, выбранного в качестве наиболее изученной модели.

3(R)-Гидрокси-(5Z,8Z,11Z,14Z)-эйкозатетраеновая кислота была наработана в препаративных количествах с использованием ацетиленовой стратегии синтеза, ключевым моментом которой является реакция кросс-сочетания терминальных ацетиленовых фрагментов и синтонов пропаргильного типа. Были проведены исследования индикативных характеристик стресса у грибов под воздействием разных концентраций 3-НЕТЕ: изменение содержания карбонильных групп в белках мицелия гриба и концентрации каротиноидов при световом инкубировании. Применяемые биохимические методики позволяют рассчитать количественные характеристики на основе спектрофотометрических данных. Было показано, что микромолярные концентрации 3-НЕТЕ влияют на содержание каротиноидов у N. crassa дозозависимым образом, оптимальной для выработки каротиноидов оказались концентрации 5-10 мкМ. Было определено повышение содержания карбонильных групп в белках под влиянием 3-HETE в микромолярных концентрациях (1-5 мкМ), что указывает на развитие оксидативного стресса у грибов.

Исследование мицелия гриба на разных стадиях роста при помощи микроскопа позволило установить, что добавление 3-НЕТЕ в питательную среду снижает скорость роста гиф, усиливая при этом их агрегацию, а также ингибирует спорообразование N. сrassa.

Особую благодарность выражаю к.х.н. с.н.с. Грозе Н.В. (МИТХТ им. М.В.Ломоносова) и д.б.н. проф. Белозерской Т.А. (Институт биохимии им. А.Н.Баха) за помощь в проведении исследований и интерпретации результатов.

NADH: убихинон оксидоредуктаза (комплекс I) из митохондрий мозга Калашников Денис Сергеевич (Москва, denis.kalashnikov@gmail.com) Комплекс I, или митохондриальная протон-транслоцирующая NADH:убихинон оксидоредуктаза (ЕС 1.6.99.3) наиболее сложно устроенный компонент дыхательной цепи.

Каталитические свойства и механизмы регуляции фермента полно изучены с использованием препаратов полученных из сердца млекопитающих или на примере прокариотических гомологов фермента, NDH-1. Неясен вопрос о различиях в каталитических свойствах и возможная специфика регуляции комплекса I из различных тканей в норме и патологии. Мы впервые получили препарат сопряженных субмитохондриальных частиц из митохондрий мозга свиньи (М-СМЧ). М-СМЧ катализируют NADH-оксидазную (0,8 мкмоль/мин на мг белка) и NADH:Q1-редуктазную реакции (0,6 мкмоль/мин на мг белка) чувствительные к ротенону (30 C и рН 8,0). Величина дыхательного контроля сопряженных с помощью олигомицина М-СМЧ при окислении NADH составляет 5 в присутствии БСА (2 мг/мл в пробе) и 6-7 в присутствии подобранной концентрации poly-Lys, но в отсутствие БСА. Дыхательный контроль ~3, когда субстратом дыхания является сукцинат. Содержание комплекса I в препарате (0,06 нмоль/мг) оценили с помощью титрования NADH-оксидазной активности М-СМЧ с помощью пиерицидина, ротенона и NADH-OH, специфического ингибитора, прочно связывающегося с активным центром фермента. Содержание цит. a в полученном препарате составляет 0,17-0,нмоль/мг белка (для расчетов использовали миллимолярный коэффициент экстинкции А605 равный 24/cm). По стимуляции каналообразущим антибиотиком аламетицином NADHоксидазной активности в присутствии разобщителя оценивали содержание правильно ориентированных (inside-out) М-СМЧ, составляющее ~70%. Мы обнаружили, что пальмитиновая кислота в присутствии Ca2+ приводит к необратимому ингибированию NADH:Q1-редуктазной активности М-СМЧ при щелочных значениях рН. Ингибирование развивается во времени и приводит к выходу части субъединиц комплекса I в супернатант, на что указывает обнаруженная нами в супернатанте NADH:гексааминорутений-редуктазная активность. С помощью электрофореза по методу Лэммли в супернатанте обнаруживается полоса с кажущейся молекулярной массой порядка 56 кДа. Это указывает на то, что под действием пальмитиновой кислоты происходит солюбилизация FP-фрагмента комплекса I, Ca2+ способствует этому. Эффект специфичен для пальмитиновой кислоты, по сравнению с другими длинноцепочечными жирными кислотами, не связан с действием пальмитиновой кислоты на переходы между активной и деактивированной формами комплекса I.

Накопление длинноцепочечных жирных кислот в присутствии Ca2+ может способствовать ингибированию активности комплекса I в митохондриях при ишемии. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ 08-04-00594 и NIH Fogarty 5R03TW007825.

Окислительное фосфорилирование в мембранах суббактериальных частиц Paracoccus denitrificans Кегярикова Карина Александровна (Москва, Kari6ok@gmail.com) Прочно-сопряженные суббактериальные частицы Paracoccus denitrificans способны к зависимому от энергизации мембраны и генерирующему протон-движущую силу гидролизу АТР. Стационарный гидролиз АТР протекает через упорядоченный механизм, согласно которому после акта гидролиза АТР в первую очередь из активного центра диссоциирует ADP, после чего протекает необратимая диссоциация Pi. Нами было показано, что связывание субстратов (ADP и Pi) в реакции синтеза АТР, катализируемой F0·F1 АТРазой P.

denitrificans, протекает неупорядоченно. Сравнение стационарной кинетики гидролиза и синтеза АТР показало, что обратимость F0·F1 АТРазы не может быть описана функционированием одной и той же молекулы фермента. Для дальнейшего развития данной гипотезы, мы регистрировали параллельно синтез АТР, генерацию мембранного потенциала и дыхание СБЧ P. denitrificans. Добавление СБЧ в среду, содержавшую NADH, сопровождалось генерацией мембранного потенциала. Инициация синтеза АТР добавлением АDP было сопряжено с резким падением мембранного потенциала, которое увеличивало нагрузку на дыхательную цепь, а это проявлялось в увеличении скорости дыхания.

Интересно, что в процессе синтеза АТР мембранный потенциал медленно увеличивался при постоянной скорости реакции, хотя рост мембранного потенциала можно было ожидать только после завершения реакции. Дыхание частиц переходило в контролируемое состояние в тот момент, когда синтез АТР заканчивался. Считается, что это происходит, после того как весь добавленный ADP фосфорилируется до АТР. Мы определили, сколько ADP превратилось в АТР к моменту перехода дыхания в контролируемое состояние, и обнаружили, что из 100 мкМ внесенного ADP образовалось только ~85 мкМ АТР, а ~10 мкМ ADP осталось в среде. Учитывая, измеренную нами ранее величину Km для ADP (7-8 мкМ), можно предположить, что уменьшение концентрации ADP в реакционной среде не является причиной завершения реакция синтеза АТР. Мы предполагаем, что процессы синтеза и гидролиза АТР катализируются разными формами F0·F1 АТРазы – синтетазной и гидролазной. Соотношение между ними зависит от протон-движущей силы и стационарного значения АТР/ADP. Сенсором этих параметров может служить -субъединица F0·Fкомплекса, связывающая АТР.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 08-04-00594.

Активность 5-аминолевулинат-синтазы в митохондриальной фракции печени крыс с трансплантированной карциномой Герена Кеца О.В., Мудрак М.С. (Украина, Черновцы, ksen808@mail.ru) Снижение содержания митохондриальных гемопротеинов печени в условиях роста карциномы Герена в организме могут привести к уменьшению энергетического потенциала клеток, снижению пластических процессов в организме и развитию эндотоксемии. Уровень активности ключевого фермента синтеза гема определяет содержание последнего в печени и последующую утилизацию его для синтеза гемопротеинов. Ферментативная активность 5-аминолевулинат-синтазы (АЛК-синтазы) митохонрий тесно связана с содержанием и активностю гемопротеинов, в частности, митохондриальных цитохромов.

Цель работы – изучение активности 5-аминолевулинат-синтазы в митохондриальной фракции печени крыс с трансплантированной карциномой Герена.

Результаты исследования показали увеличение активности АЛК-синтазы в митохондриальной фракции печени крыс-опухоленосителей на 7-е сутки после трансплантации карциномы Герена. Наблюдаемые изменения могут быть связаны с повышенными потребностями клеток печени в синтезе гема в условиях роста в организме карциномы Герена. В тоже время, интенсивное расходование сукцината для синтеза гема уменьшает его использование дыхательной цепью митохондрий печени экспериментальных животных. Уменьшение фонда эндогенных субстратов в митохондриях может привести к развитию низкоэнергетического сдвига.

На логарифмической и терминальной стадии онкогенеза (14-е и 21-е сутки после трансплантации карциномы Герена) наблюдается снижение активности АЛК-синтазы в митохондриальной фракции печени крыс-опухоленосителей. Вероятно, активация окислительных процессов в период активного и терминального роста опухоли приводит к окислительной модификации фермента и, как следствие, к понижению ферментативной активности. С другой стороны, снижением активности АЛК-синтазы в наших опытах может привести к развитию высокоэнергетического сдвига, вследствии монополизации дыхательной цепи янтарной кислотой, что связано со значительным образованием янтарной кислоты из других соединений и уменьшением оттока сукцината для синтеза гема в условиях онкогенеза.

Таким образом, в условиях роста в организме карциномы Герена в митохондриальной фракции печени наблюдаются значительные изменения активности фермента синтеза гема.

Активация фермента АЛК-синтазы на начальном этапе онкогенеза постепенно снижается в период логарифмической и терминальной стадий онкогенеза, следствием чего может быть уменьшение содержания митохондриальных гемопротеинов.

Pages:     | 1 |   ...   | 12 | 13 || 15 | 16 |   ...   | 85 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.