WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 11 | 12 || 14 | 15 |   ...   | 85 |

При встраивании фрагмента по сайтам рестрикции NcoI и XhoI рекомбинантный белок содержал сигнальную pelB последовательность для экспорта в периплазму; при встраивании по сайтам NdeI и XhoI белок не содержал сигнальной последовательности и накапливался в цитоплазме клетки. Рекомбинантный N-IGFBP-4 был экспрессирован в клетках E. coli штаммов BL21pLysS, Rosetta и Origami и идентифицирован методами электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия и иммуноблоттинга с использованием специфических антител к N-IGFBP-4. В дальнейшем клетки экспрессионных культур были подвергнуты фракционированию для анализа распределения рекомбинантного белка между растворимой фракцией и фракцией телец включения методами электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия и иммуноблотинга. Было показано, что рекомбинантный N-IGFBP4 присутствует в растворимой и нерастворимой формах в клетках всех использованных штаммов E. coli. Иммунохимическая активность рекомбинантного N-IGFBP-4 была проанализирована методом иммунного анализа «сэндвич» типа. Таким образом, в результате нашей работы были получены молекулярно-генетические конструкции для экспрессии рекомбинантного N-IGFBP-4 в периплазме и цитоплазме E. coli, проведена тестовая экспрессия рекомбинантного N-IGFBP-4 в клетках различных штаммов E. coli, и показана иммунохимическая активность рекомбинантного белка. Полученный рекомбинантный NIGFBP-4 может быть использован в качестве стандарта при измерении концентрации расщепленного IGFBP-4 в крови пациентов. Авторы выражают признательность к.б.н.

Д.В. Серебряной за помощь в работе и подготовке тезисов.

Изменчивость цитохромов Р450 микобактерий комплекса Mycobacterium tuberculosis Василевская Анна Викторовна (Белоруссия, Минск, vasilevskaya@iboch.bas-net.by) Туберкулёз – инфекционное заболевание, от которого ежегодно умирает около 8 млн.

человек. Особое опасение вызывает тот факт, что постоянно увеличивается число штаммов микобактерий, устойчивых к противотуберкулёзным препаратам. Устойчивость к действию лекарственных препаратов обусловлена либо модификацией белка мишени лекарства, либо метаболизмом данного препарата. Цитохромы Р450 (Р450) выполняют ключевые функции в метаболизме микобактерий и потенциально могут участвовать в деградации большинства противотуберкулёзных препаратов. Изменчивость данных ферментов может рассматриваться как один из возможных путей возникновения новых форм микобактерий, устойчивых к действию лекарственных препаратов.

Сравнение последовательностей M.tuberculosis и M.bovis позволило определить отличия в генах, кодирующих цитохромы Р450: ген cyp51 – T342C; ген cyp125 – C1125T; ген cyp132 – G404T; ген cyp135A1 – C298T (АК замена H100Y); ген cyp136 – C951T; ген cyp136 – A1334G (АК замена D445G); ген cyp137 – G406C (АК замена E136Q); ген cyp139 – C84T; ген cyp144 – C972G (АК замена H324Q). Результаты исследований показали относительную консервативность структуры и состава Р450 микобактерий комплекса M.tuberculosis, что, повидимому, обусловлено участием данных ферментов в росте и развитии патогенных микобактерий.

Кроме того, нами было проведено секвенирование и анализ точечных мутаций генов Ру различных изолятов M.tuberculosis и M.bovis, а также форм микобактерий, устойчивых к противотуберкулёзным препаратам. В результате анализа клинических образцов были обнаружены следующие точечные мутации: cyp139 M.bovis – G1143A; cyp144 M.bovis – A534G; cyp143A1 M.bovis – A1160C (АК замена N387T); cyp141 M.tuberculosis (клинический изолят устойчивый к амикацину и капреомицину) – A469G (АК замена K157E). Следует отметить, что большинство АК замен расположено в лиганд-связывающей области ферментов (области, прилегающие к регионам SRS1, SRS2, SRS5, SRS6, а также области, ответственной за координацию атома железа гема – область L спирали). Локализация АК замен в области субстрат-связывающего канала и активного центра фермента может говорить о потенциальном участии данных замен в определении специфичности Рмикобактерий по отношению к субстратам или ингибиторам, что обуславливает более благоприятную жизнедеятельность микобактерий в определённом организме, или связано с увеличением степени резистентности к действию определенных групп противотуберкулёзных препаратов.

Таким образом, Р450 (исследование структуры, метаболического профиля и поиск изоферментных различий резистентных и нерезистентных микобактерий), может быть перспективным направлением в области диагностики и лечения туберкулёза. Дальнейшее исследование значительно упростит процесс создания новых противотуберкулёзных препаратов, механизм действия которых связан с Р450, а также поможет выяснить механизмы участия данных ферментов в жизнедеятельности и патогенезе микобактерий.

Изучение экспрессии рекомбинантного PAPP-A в клетках культуры HEK с использованием сигнального пептида Markov Гладышев Г.В., Кулебякин К.Ю. (Москва, GG.Nurfed@gmail.com) Димерная форма белка плазмы крови А, ассоциированного с беременностью (dРАРР-А), является биомаркером дестабилизации атеросклеротических бляшек, что позволяет использовать её для ранней диагностики такого серьезного заболевания, как острый коронарный синдром (Bayes-Genis et al., 2001). Для иммунохимического определения концентрации dPAPP-A в крови пациентов необходим калибратор, в качестве которого может быть использован рекомбинантный dРАРР-А. Таким образом, создание новых и улучшение существующих систем получения рекомбинантного dРАРР-А представляет собой актуальную задачу с прикладной биомедицинской точки зрения.

Одним из возможных способов модификации систем экспрессии рекомбинантного dРАРР-А является использование сигнального пептида секреции, предсказанного in silico при помощи hidden Markov model (Markov) (Barash et al., 2002). Этот сигнальный пептид был предсказан на основании анализа 416 сигнальных пептидов и теоретически должен обладать повышенной эффективностью. Таким образом, целью данной работы было исследование экспрессии рекомбинантного dPAPP-A в эукариотических клетках линии HEK, с использованием сигнального пептида Markov.

Нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая фрагмент РАРР-А вместе с сигнальным пептидом Markov, была вначале встроена в вектор PBC SK+, содержащий недостающий фрагмент гена PAPP-A, по сайтам рестрикции HindIII и EcoRI для получения кДНК полноразмерного PAPP-A. Затем кДНК полноразмерного PAPP-A была встроена в вектор рСЕР4 для эукариотической экспрессии в клетках по сайтам рестрикции HindIII и NotI. Полученную плазмиду использовали для трансфекции клеточной линии HEK с помощью трансфекционных реагентов Fugene, Lipofectamin 2000 и Unifectin 56. В качестве контроля сравнения использовали плазмиду для экспрессии рекомбинатного PAPP-A с сигнальным пептидом активатора плазминогена. Методом иммуноферментного анализа было показано, что экспрессия и секреция рекомбинантного dPAPP-A с сигнальным пептидом Markov происходит в 10 раз эффективнее, чем с сигнальным пептидом активатора плазминогена. Наиболее высокие уровни экспрессии dPAPP-A, – около 200 нг мл-1 день-1, наблюдаются в случае использования реагента Unifectin 56.

Таким образом, в результате нашей работы была получена плазмида и подобраны условия для эукариотической экспрессии рекомбинантного РАРР-А. Экспрессия и секреция рекомбинантного dPAPP-A в случае сигнального пептида Markovпроисходит гораздо эффективнее, чем в случае сигнального пептида активатора плазминогена.

Авторы выражают признательность к.б.н. Серебряной Д.В. и д.б.н. Катрухе А.Г. за ценные советы и помощь в подготовке тезисов.

Структурные особенности цитопротекторных соединений простаноидной природы Губич Оксана Игоревна (Белоруссия, Минск, Hubich_Oksana@mail.ru) CCl4 – хорошо известный гепатотоксин, являющийся причиной случайных, суицидальных и профессиональных интоксикаций. Поступление CCl4 в организм человека и высших животных вызывает некроз клеток печени, что лежит в основе последующего развития цирроза печени и летального исхода. В исследованиях, выполненных нами ранее, показана способность ряда синтетических аналогов простагландинов (ПГ), синтезированных в Лаборатории химии простагландинов ГНУ «Институт биоорганической химии НАН Беларуси», проявлять выраженные гепатопротекторные эффекты in vitro.

Целью данной работы явилось изучение связи структура-цитопротекторная функция в ряду синтетических аналогов ПГ групп В, Н и Е на клеточной модели повреждения печени CCl4. В ходе работы выявлено 7 аналогов ПГВ, 3 производных ПГН и 2 11-дезокси-аналога ПГЕ1, снижавших индекс цитотоксичности для CCl4 более, чем в 2 раза, и оказавшихся более эффективными, чем такие известные гепатопротекторы, как силимарин, куркумин и ПГI2. Эти простаноиды снижали образование триеновых конъюгатов в клеточных мембранах на 25-95% и предотвращали утечку лактатдегидрогеназы через плазматические мембраны.

Структурно-функциональный анализ данных соединений позволил выявить следующие закономерности: 1) синтетические аналоги ПГВ являются более сильными гепатопротекторами, чем простаноиды Н и Е-группы; 2) присутствие 2-пиридила при С15 в -цепи простаноида серии Н играет первостепенную роль в проявлении им свойств цитопротектора; 3) среди аналогов 11-дезокси-ПГЕ1 наиболее активные соединения обладают фенильным циклом при С15, соединенным с С13 изоксазолином или Сизоксазолом; 4) С13- циклогексиламин или С15 фенильная группировка в -цепи и метоксильная группа в -цепи необходимы для проявления простаноидами типа В протекторной активности.

Работа выполнена в рамках программы ГПОФИ «Физиологически активные вещества» (задание 3.16). Автор выражает глубокую благодарность к.б.н., доценту Шолуху М.В. за помощь в выполнении работы.

Прооксидантно-антиоксидантное равновесие в печени крыс при длительном угнетении желудочной секреции соляной кислоты Дворщенко Е.А., Сенин С.А. (Украина, Киев, k21@univ.kiev.ua) Длительное использование ингибиторов кислотной секреции желудка при лечении гиперацидных состояний снижает выделение секретина и холецистокинина, что угнетает желчную секрецию, вызывая нарушения в гепатобилиарной системе. Неспецифическим механизмом структурно-функциональных изменений клеток при патологии является нарушение баланса между образованием активных форм кислорода и их нейтрализацией.

Последнее приводит к активации процессов перекисного окисления липидов и, как следствие, к повреждению мембранных структур гепатоцитов.

Целью наших исследований было изучить состояние окислительно-антиоксидантного равновесия в печени крыс в условиях длительного угнетения секреции соляной кислоты.

Эксперименты проведены на белых нелинейных половозрелых крысах-самцах.

Гипоацидное состояние моделировали внутрибрюшинным введением 14 мг/кг “Омеза®” (1 раз в сутки) на протяжении 28 дней. В качестве контроля использовали крыс, которым на протяжении 28 суток вводили внутрибрюшинно 0,2 мл воды для инъекций. Изучение показателей окислительно-антиоксидантного баланса в гомогенате печени проводили через сутки после последнего введения “Омеза®”. Липиды экстрагировали по методу Фолча хлороформ-метанольной смесью (2:1, по объему). Спектры функциональных групп липидов снимали на инфракрасном Фурье-спектрометре “Nexus” (“Thermo Nicolet”, США), оборудованным датчиком DTGS. Измерение площадей пиков на инфракрасных спектрах проводили с использованием программного обеспечения прибора OMNIC (версия 5.1).

Содержание диеновых конъюгатов (ДК) определяли в гептан-изопропанольном экстракте спектрофотометрическим методом, шиффовых оснований (ШО) – флуориметрическим методом, ТБК-активных соединений (ТБК-АС) – по реакции с тиобарбитуровой кислотой.

Оценку активности супероксидисмутазы (СОД) проводили с использованием нитросинего тетразолия, каталазы – по уменьшению количества Н2О2 в растворе после инкубации в оптимальных условиях.

После длительного угнетения секреции соляной кислоты омепразолом, в печени крыс установлены изменения в структурной организации липидов: возрастало содержание гидроксильных групп – 2,4 раза; альдегидных групп – в 1,7 раза, фосфатных групп – в 1,4 раза и транс-изомеров – в 1,2 раза, при этом снижалось количество карбонильных групп – в 1,3 раза и цис-изомеров – в 1,5 раза относительно контроля. Показано, что после 28-суточного введения животным “Омеза®”, содержание продуктов пероксидации липидов увеличивалось: ДК – в 2,2 раза, ТБК-АС – в 1,7 раза и ШО – в 1,6 раза относительно контроля, при одновременном снижении активности ферментов антиоксидантной защиты:

СОД и КАТ – в 1,2 раза по сравнению с контролем.

Результаты проведенных исследований показали, что длительное гипоацидное состояние приводит к сдвигу окислительно-антиоксидантного равновесия в гепатоцитах в сторону интенсификации процессов свободнорадикального окисления липидов, что свидетельствует о развитии оксидантного стресса в клетках печени.

Выражаем благодарность Остапченко Людмиле Ивановне и Береговой Татьяне Владимировне за предоставленную возможность проведения наших исследований.

Антиоксидантные и прооксидантные свойства некоторых флавоноидов Долгодилина Елена Викторовна (Белоруссия, Минск, leka.dol@mail.ru) Окисление чужеродных веществ, поступающих в организм, часто сопровождается образованием радикальных продуктов реакции. Наиболее эффективным средством защиты организма от патологического действия активных форм кислорода (АФК) и других радикальных продуктов являются антиоксидантные вещества фенольной природы, к которым относятся и флавоноиды. Биологическая активность флавоноидов обусловлена наличием реактивных гидроксильных и карбонильных групп. Наряду с акнтиоксидантным действием флавоноиды могут проявлять и прооксидантную активность.

Pages:     | 1 |   ...   | 11 | 12 || 14 | 15 |   ...   | 85 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.