WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 10 | 11 || 13 | 14 |   ...   | 85 |

Исследование кинетических характеристик цитоплазматической -глюкозидазы растений гороха Баркалова Оксана Николаевна (Воронеж, oks-bar@mail.ru) -Глюкозидаза (-D-глюкозидгидролаза, ЕС 3.2.1.21) избирательно катализирует гидролитическое расщепление -глюкозидной связи между двумя остатками глюкозы или между глюкозой и арил- или алкил-агликоном. В растениях гороха обнаружена -глюкозидаза, расщепляющая специфический для этого растения изосукцинимид-гликозид (ИС-гликозид), агликоном которого является циклическое производное гаммааминомасляной кислоты. Объектом исследования служили 10-дневные проростки гороха (Рамонский 77), из которых был получен электрофоретически гомогенный ферментативный препарат цитоплазматической -глюкозидазы с удельной активностью 731,7 Е·мг-1 при высаливании сульфатом аммония и очисткой с помощью гель-хроматографии на G-25 и G-100. При исследовании субстратной специфичности цитоплазматической -глюкозидазы использовали раффинозу (16 и 12 связи), целлобиозу (14), мальтозу (14), лактозу (14), ИС-гликозид и -метил--D-глюкозид в концентрациях 10-10мМ. Было показано, что фермент проявлял наибольшую активность, расщепляя ИС-гликозида (Кm=0,58 мМ). -Глюкозидаза не расщепляла раффинозу, лактозу и мальтозу, но проявляла высокую активность в присутствие -метил--D-глюкозида (Кm=0,76 мМ). При анализе зависимости активности фермента от величины рН среды, V=f(pH) определили значения рК ионогенных групп белка, участвующих в акте катализа. Они соответствуют рК1 4,3 (близко карбоксильной группе) и рК2 6,4 (имидазола гистидина (рК=5,6-7,0). Расчеты величины Н оказались равными 5,6 кДж·моль-1 и 33,9 кДж·моль-1, что соответствовало теплоте ионизации карбоксильной группы и имидазольной группы. Фотоинактивация фермента в присутствии метиленового синего и ДЭПК (10-6М) доказали наличие имидазольной группы гистидина в активном центре фермента. Полученные результаты по изучению свойств цитоплазматической -глюкозидазы растений гороха показали, что фермент обладает высокой специфичностью к типу расщепляемой связи субстратов и гидролизует только 14 связи, отщепляя -глюкопиранозильные остатки. В разрыве гликозидной связи субстратов принимают участие карбоксильная группа глутаминовой либо аспарагиновой кислот и имидазольная группа гистидина.

Использование моноклональных антител к 1-субъединице Na,K-АТФазы в исследованиях механизмов адаптации фермента в почках гибернирующих сусликов Spermophilus udulatus Басевич Евгений Викторович (Москва, basevichev@mail.ru) Состояние гипотермии, наблюдаемое у некоторых мелких млекопитающих в холодное время года, позволяет выживать в условиях недостатка кормов и воды. Зимняя спячка (гибернация) наступает из-за десяти- или даже стократного снижения уровня метаболизма относительно нормотермии, обеспечивающего энергосбережение. Однако и при вялом обмене веществ сохраняется необходимость периодически выводить накапливающиеся метаболиты при кратковременных пробуждениях. Таким образом, выделительная система во время гибернации функционирует в замедленном режиме, а основным потребителем АТФ в почках является Na,K-АТФаза.

Ранее показано, что при гибернации активность микросомальной Na,K-АТФазы из почек сусликов при 37°С снижается в 2–3 раза (Charnock, 1978; MacDonald, 1999; Басевич, 2008).

В литературе высказывались предположения, что снижение активности Na,K-АТФазы связано с уменьшением содержания фермента в почках, однако убедительных доказательств приведено не было (Charnock, 1978). Поэтому в настоящей работе мы оценили количество Na,K-АТФазы в микросомальных препаратах по содержанию каталитической 1-субъединицы, единственной присущей почечной ткани. Так, методом иммуноблоттинга с использованием моноклональных антител к 1-субъединице Na,K-АТФазы с широкой межвидовой специфичностью (Clone C464.6, Millipore 05-369) показано, что при гибернации интенсивность белковой полосы с массой 102 кДа (мономер -субъединицы) снижается на 25% (p<0,005). Кроме того в качестве контроля были выявлены с помощью специфических антител полосы мембраносвязанного актина, количество которого при гибернации достоверно не изменялось (p>0,15). Таким образом, на фоне стабильного содержания клеточного белка актина, количество Na,K-АТФазы при гибернации уменьшается на четверть, что, однако, не объясняет описанное падение активности фермента в 2–3 раза.

Причиной снижения активности Na,K-АТФазы в почках сусликов при гибернации может быть агрегация фермента, описанная ранее для Ca-АТФазы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц сусликов, активность которой в условиях гипотермии снижалась более чем в 2 раза (Малышева, 2001). Для оценки олигомерного состояния Na,K-АТФазы исследуемые препараты были обработаны с разной длительностью инкубации при 37°С сшивающим агентом о-фенантролином в комплексе с ионами меди, катализирующим образование ковалентных S–S-связей между близко расположенными молекулами белков. Наблюдалось прогрессивное уменьшение интенсивности полосы мономерной формы -субъединицы Na,K-АТФазы и появление полос олигомеров, визуализированных методом иммуноблоттинга. При этом относительное количество сшитых за час молекул фермента при гибернации было в 1,68 раза больше относительно нормотермии (p<0,001). Таким образом, при гибернации почечная Na,K-АТФаза находится в более агрегированном состоянии, что наряду с показанным снижением тканевого содержания фермента обуславливает, по всей видимости, описанное падение активности Na,K-АТФазы. Поддержано грантом РФФИ 08-04-00823.

ОБМ-гидролизующая активность антител крови больных системной красной волчанкой Безуглова Анна Михайловна (Новосибирск, bezukaf@mail.ru) Известно, что у больных системной красной волчанкой (СКВ) на поздних стадиях заболевания в головном мозге томографией обнаруживаются бляшки, сходные с таковыми у больных рассеянным склерозом (РС) – аутоиммунном заболевании человека, главным маркером которого является разрушение миелиновой оболочки нейронов. Из этих данных можно сделать предположение, что деструкции клеток головного мозга при этих заболеваниях имеют аналогичный механизм.

Целью работы является изучение и сравнение протеолитической активности абзимов крови больных СКВ и РС.

Из плазмы крови больных РС, СКВ и здоровых доноров получены гомогенные препараты антител (АТ). IgG крови больных аутоиммунными заболеваниями, в отличие от здоровых доноров, эффективно гидролизовали только основной белок миелина (ОБМ) и четыре соответствующих ему олигопептида, но не другие контрольные белки, причем каталитический центр расположен на легких цепях антител. Далее было проведено сравнение каталитических свойств протеолитических абзимов. Обнаружено, что АТ больных СКВ проявляют максимальную активность при рН 8. В то же время, сотрудниками нашей лаборатории было показано, что АТ РС имеют преимущественно два пика активности: при рН 6 и 9,5. Показано, что суммарный пул АТ, полученных из сыворотки крови больных СКВ, представлен в основном протеазами, зависимыми от металлов, в отличие АТ больных РС представленых в большей степени сериновыми протеазами. Ионы различных металлов при концентрации 2 мМ увеличивали глубину реакции гидролиза в следующем порядке:

Ca2+ > Mg2+ > Co2+ > Fe2+ > Zn2+ > Mn2+ > Ni2+ > Cu2+ в случае АТ из крови больных СКВ.

Несколько иной порядок: Mg2+ > Co2+ > Ca2+ > Zn2+ > Cu2+ > Fe2+ наблюдался для АТ из крови больных РС. Для четырех лучших активаторов: Ca2+, Mg2+, Zn2+ и Co2+, были сняты концентрационные зависимости, которые имели колоколообразный характер и заметно отличались для препаратов больных РС и СКВ.

С помощью метода фагового дисплея и библиотеки кДНК легких цепей антител больных СКВ наработан пул клонов, синтезирующих легкие цепи антител. Аффинной хроматографией на ОБМ-сефарозе фаговые частицы, продуцирующие легкие цепи АТ против ОБМ, разделены на фракции, отличающиеся сродством к ОБМ. Получены моноклональные легкие цепи.

Влияние солевого стресса на функционирование ферментов метаболизма малата в диффиринцированных тканях сорго Бессмельцева Юлия Сергеевна (Воронеж, djuta@mail.ru) Наличие широкого спектра ферментов, принимающих участие в утилизации малата, позволяет ей играть существенную роль в поддержании внутренних физиологических условий клеток при стрессовом воздействии, что даёт организму дополнительные адаптационные возможности. В связи с этим, целью нашей работы было изучение влияния засоления на работу ферментов малатдегидрогеназной (МДГ) системы в клетках мезофилла и обкладки сорго, относящегося к С4-растениям. Объектом служили 14-дневные проростки сорго зернового (Sorghum bicolor L.), выращенные гидропонно. Солевой стресс моделировали 150мМ раствором NaCl, контролем служили образцы, экспонированные в воде. Мезофилл и обкладку разделяли по Клечковскому. Активность малатдегидрогеназ определяли спектрофотометрически при длине волны 340 нм. Содержание малата определяли энзиматически, используя коммерческий препарат МДГ аналитической чистоты.

Полученные данные позволяют говорить о значительных перестройках в работе МДГ-системы в клетках мезофилла и обкладки сорго под действием засоления. Показана активация НАД+-зависимых ферментов в клетках мезофилла, очевидно связанная с эффектом “солевого дыхания”. Кроме того, увеличение активности этих ферментов при стрессе необходимо для синтеза малата, способного поддерживать осмотический баланс клетки. Установлено увеличение содержания малата в мезофилле сорго в первые 6 часов солевого воздействия с последующим снижением его содержания, что вероятно является результатом усиления декарбоксилирования малата. В обкладке указанные эффекты были менее выражены по сравнению с мезофиллом. Обнаружено усиление работы НАДФ+-зависимого малик-энзима в мезофилле сорго и НАДФ+-зависимой МДГ в его обкладке, что указывает на негативное влияние стрессора на скорость работы цикла ХэтчаСлейка. Мы предполагаем, что именно НАДФ+-МДГ обеспечивает в накопление малата в клетках обкладки опытных растений. Таким образом, индуцированные засолением изменения в работе МДГ системы главным образом направлены на интенсификацию цикла Кребса, необходимую для энергизации клеток, и на дополнительный синтез малата, способного выполнять осмолитические функции. Исследуемая ферментная система в клетках мезофилла сорго более лабильна в стрессовых условиях по сравнению с обкладкой.

Специфичность мест встраивания каротиноидов в светособирающий комплекс В800-850 из Alc. minutissimum Большаков Максим Александрович (Пущино, lfbv22@rambler.ru) Цель работы – исследовать избирательность встраивания каротиноидов в комплекс LHиз серной фотосинтезирующей бактерии Alc. minutissimum. Упрощенная схема спририллоксантинового пути биосинтеза каротиноидов представлена следующей цепочкой:

– ликопин – родопин – дидегидрородопин – ангидрородовибрин – родовибрин – спириллоксантин. В комплексе LH2 Alc. minutissimum основным каротиноидом является родопин. В него встраивали каротиноиды из более поздних этапов биосинтеза (спириллоксантин, ангидрородовибрин из Rps. rubrum).

Бескаротиноидные мембраны выделяли из клеток Alc. minutissimum, выращенных с ДФА (12 мг/л). Каротиноиды из Rps. rubrum выделяли методом экстракции ацетон/метанольной смесью с последующим переводом в петролейный эфир и высушивали током аргона. Состав экстракта: спириллоксантин 88%, родопин 8,7% и ангидрородовибрин 3,3%. Встраивание проводили путем дробного добавления экстракта каротиноидов в ацетон/метаноле (А490=0.7) к бескаротиноидным хроматофорам Alc. minutissimum, с последующим диализом для удаления растворителей. Анализ каротиноидного состава проводили методом ВЭЖХ на колонке Spherisorb ODS2, используя детектор с диодной матрицей SPD-M20A. Спектры поглощения образцов регистрировали на спектрофотометре Cary 50.

Максимальное увеличение полосы поглощения каротиноидов (~30% от контроля) получено при 3-х кратном добавлении экстракта. В этом случае в LH2 комплекс встраивался преимущественно родопин. Дальнейшее добавление экстракта вызывало быстрое разрушение LH2 комплекса и в его спектре поглощения присутствовало значительное количество мономерного БХЛ (полоса при 780 нм). Реэлектрофорез этой фракции, позволил выделить небольшое количество LH2 комплекса, в котором основным каротиноидом был спириллоксантин (36,5%). Чтобы доказать специфичность встраивания каротиноидов в LHкомплекс, использовали смесь экстрактов из Rps. rubrum и Alc. minutissimum (основной каротиноид – родопин) в разном соотношении (1:1 и 1:4). В комплекс LH2 встраивался преимущественно родопин. В LH1 комплекс всегда встраивался спириллоксантин, даже при условии, что его было недостаточно для максимального встраивания. Обсуждаются процессы встраивания каротиноидов в комплексы LH2 in vivo.

Клонирование и экспрессия рекомбинантного N-концевого фрагмента IGFBP-в клетках E. coli Бродская О.М., Агаронян К.М. (Москва, olga3511@yandex.ru) Белок IGFBP-4 является специфичным субстратом для протеазы РАРР-А, присутствующей в нестабильных атеросклеротических бляшках в виде димерной активной формы. РАРР-А расщепляет IGFBP-4 на единственном участке белка между остатками Met135 и Lys136. Предполагается, что наличие в крови расщепленной формы IGFBP-4, как маркера активности РАРР-А, может свидетельствовать о риске возникновения острого коронарного синдрома. Поэтому тест-система антител для детектирования расщепленной формы IGFBP-4 может служить инструментом для диагностики патологических состояний, связанных с сердечной недостаточностью. Для адекватного определения концентрации фрагментов IGFBP-4 в крови пациентов в качестве калибраторов необходимо использовать очищенные фрагменты IGFBP-4. Получение фрагментов IGFBP-4 с помощью протеолиза PAPP-A или в эукариотической экспрессионной системе неэффективно, поскольку выход конечного продукта в обоих случаях достаточно низкий. Более эффективным с этой точки зрения подходом является получение фрагментов IGFBP-4 в бактериальной системе экспрессии E. coli. Таким образом, целью нашей работы было получение рекомбинантного N-концевого фрагмента IGFBP-4 в экспрессионной системе E. coli.

кДНК N-IGFBP-4 была получена методом ПЦР реакции со специфическими праймерами.

Полученные фрагменты были встроены в вектор pET22b+ для экспрессии в клетках E. coli.

Pages:     | 1 |   ...   | 10 | 11 || 13 | 14 |   ...   | 85 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.