WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 || 10 | 11 |   ...   | 19 |

Шкалу стандартных растворов готовят таким же образом в пределах от 1 до 20 мкг Сu. Содержание меди в пробе определяют по калибровочному графику и вычитают из него результат холостого опыта. Дальнейший расчет содержания ведут с учетом навески и разведения по формуле:

a •V0, X = н •Vгде Х — содержание меди, мг/кг; а — содержание элемента, найденное по графику, мкг; V0– исходный объем вытяжки; V1– объем вытяжки, взятый на определение, мл; н — навеска почвы, г.

Лабораторная работа № 37 (2 часа) Определение содержания кобальта в почве с нитро-R-солью Реактивы 1. Маскирующий раствор: смешать равные объемы 20 %- ного раствора трехзамещеного лимоннокислого натрия.

2. Смесь кислот: 100 мл 85 %-ного раствора Н3РО4 смешать с 20 мл концентрированной Н3РО4.

3. Нитро- R-соль, 0,05 %-ный раствор: 0,5 г реактива растворить в бидистиллированной воде и довести объем до 1 л водой.

Ход определения Для определения подвижных форм кобальта взять 25–50 мл 1N НNO3 вытяжки, 100 мл вытяжки уксуснокислого натрия по Кругловой, 50–100 мл аммонийно-ацетатных вытяжек с рН 4,8 и с рН 4,5 по Соловьеву и поместить в термостойкий стакан. Прилить 2 мл конц. НNO3 и 2 мл Н2О, выпарить на закрытой плитке или песчаной бане досуха. Провести вторичную обработку осадка 1мл конц. НNO3 и 1 мл Н2О и опять выпарить досуха. К осадку прилить 6 мл бидистиллированной воды, подкисленной (1:100) НС1, довести раствор до кипения, прибавить 2 мл маскирующей смеси и кипятить 1 мин. Реакция раствора должна быть 5,6–6,0, поэтому в случае необходимости ее доводят до нужной, прикапывая уксуснокислый натрий. Затем к анализируемому раствору прилить 2 мл 0,05 %-ного раствора нитро-R-соли, 5 мл воды и довести до кипения. Растворы охладить, прилить 3 мл смеси Н3РО4 и НNO(5 частей 85 %-ного Н3 РО4 и 1 часть концентрированной НNO3 и сразу же перемешать. Растворы перенести в градуированные пробирки на 20 мл, довести объем до метки водой и, перемешав, фотометрировать относительно воды в кюветах на 2 см при длине волны 520–536 нм (с зеленым светофильтром).

Для построения калибровочного графика в 10 мерных колбочек на 100 мл набирают 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10 мл стандартного раствора, содержащего 10 мкг Со/мл. Затем в колбочки доливают до 10 мл воды, 2 мл маскирующего раствора, 2 мл 0,05 % -ного раствора нитро-R-соли и нагревают до кипения. Охлаждают растворы и приливают 3 мл смеси Н3РО4 и НNO3 кислот и доводят объем до 20 мл. На основе полученных данных строят калибровочный график, по нему определяют содержание кобальта в пробах.

Лабораторная работа № 38 (2 часа) Определение содержания кадмия в почве В делительную воронку на 150 мл взять аликвотную часть анализируемого раствора или вытяжки, содержащих от 2 до 40 мкг кадмия. Дитизонат кадмия и цинка легко разлагается разбавлением соляной кислоты (рН 2,0), тогда как дитизонаты никеля и кобальта остаются неизменными, поэтому растворы для отделения от мешающих элементов никеля и кобальта подкисляют до рН 2,10 %-ным р-ром НС1. Для определения неразложившихся комплексов прибавить порциями по 5 мл раствор дитизона в четыреххлористом углероде, после интенсивного встряхивания и разделения фаз органическую фазу отбросить и повторять экстракцию до тех пор, пока окраска последней порции дитизона останется неизменной. К водному раствору добавить 10 мл 20 %-ный раствор сегнетовой соли (татрата калия, натрия), 0,5 мл раствора диметилглиоксима, по каплям добавить аммиак до нейтральной реакции и хорошо перемешать.

Затем для предотвращения окисления дитизона присутствующими окислителями, особенно марганцем, прилить 1 мл 20 %-ного раствора гидроксиламина и 40 %-ный раствор щелочи натрия в таком количестве, чтобы концентрация его в анализируемом растворе составила не менее 5–10 %. При такой щелочной реакции дитизонат кадмия остается устойчивым, тогда как дитизонаты свинца, цинка, олова и некоторых других мешающих катионов разрушаются, а поэтому экстрагируются только комплексы кадмия. Дитизонаты кадмия экстрагируются несколькими порциями по 5 мл раствора дитизоната в СС14 до тех пор, пока дитизон не перестанет приобретать розовую окраску. Объединенные органические экстракты поместить в делительную воронку, промыть сначала 0,5 %-ным раствором щелочи натрия и водой, перенести в мерную колбу на 25 или 50 мл (в зависимости от количества кадмия), довести до метки СС14 и фотометрировать при длине волны 520 нм (зеленый светофильтр) относительно чистого СС14.

Расчет ведут по формуле:

a •V0 •1000 a •V0, X = = н •V1 •1000 н •Vгде Х — содержание кадмия, мг/кг; а — содержание кадмия в пробе, найденное по графику, мкг; Vо — исходный объем вытяжки или раствора, мл; V1 — объем вытяжки или раствора, взятый на определение, мл; н — навеска, г.

Лабораторная работа № 39 (2 часа) Периодатный метод определения марганца При определении валового содержания марганца из фильтрата после разложения образца тем или иным способом отбирают часть (аликвотную), соответствующую 0,2–0,3 г почвы, а при определении подвижной формы 10–15 мл вытяжки помещают в фарфоровую чашку или в термостойкий стакан на 50 мл, прибавляют 5 мл концентрированной азотной кислоты и 2 мл перекиси водорода и выпаривают досуха. Сухой остаток обрабатывают еще 2–3 раза азотной кислотой и перекисью водорода в целях вытеснения НС1 и окисления восстановителей. После каждой обработки азотной кислотой остаток высушивают на плитке до полного удаления этой кислоты.

К сухому остатку приливают 25 мл 10 %-ного р-ра Н2SOи нагревают до полного его растворения. Приливают в стаканчик 20 мл воды, прибавляют 2 мл Н2РО4 (плотности 1,7) и 1 мл 2,5 %-ного раствора азотнокислого серебра, перемешивают и вносят около 0,5 г сухой соли КJО4, нагревают раствор до кипения и кипятят до полного окисления марганца. После охлаждения раствор переносят в мерную колбочку на 50 мл, доводят объем до метки водой или 10 %-ным раствором серной кислоты.

Серию эталонных растворов от 0,1 до 2,0 мг в пробе готовят таким же образом, как и анализируемую пробу. Фотометрирование проводят при длине волны 525 нм относительно Н2О.

Определение марганца с формальдоксидом Реактивы 1. Раствор формальдоксима (запасной): 123 г солянокислого гидроксиламина растворить в 700 мл воды, добавить 172 мл 37 %-ного р-ра формалина и довести объем водой до 1 л. Раствор может храниться до 1 месяца. В день проведения анализа из него готовят рабочий раствор, для чего 200 мл запасного раствора разбавляют дистиллированной водой до 1 л.

2. Аммиачный буфер (запасной): 68 г хлористого аммония растворить в 57 мл 25 %-ного раствора аммиака и довести водой до 1 л. Рабочий раствор готовят разбавлением запасного в 10 раз.

3. Маскирующий раствор: 4 г аскорбиновой кислоты растворить в 500 мл 3 %-ного раствора трилона Б.

4. Стандартный раствор марганца (запасной): 2,730 г МnSO4, предварительно прокаленного до постоянного веса, растворить в воде и добавить 10 мл серной кислоты и довести объем до 1 л.

Раствор содержит 1 мг/мл Мn. Рабочие растворы готовят соответствующим разбавлением запасного.

Ход анализа В мерную колбочку на 50 мл взять аликвоту вытяжки из почвы с содержанием марганца от 10–20 мкг, прибавить 5 мл рабочего раствора формальдоксима и 15 мл рабочего аммиачного буферного раствора, перемешивая содержимое колбочки после прибавления каждого реактива. Оставить на 5–10 мин для полного развития окраски. Затем прилить 2,5 мл маскирующего раствора и перемешать, оставить на 10 мин для разрушения комплекса формальдоксима железа и довести водой до метки. Раствор фотометрировать не позднее чем через 30 мин при длине волны 490 нм (сине-зеленый светофильтр) относительно Н2О. Калибровочную кривую строят в интервале 10–15 мкг марганца в пробе.

Лабораторная работа № 40 (6 часов) Определение влияния различных доз токсичных тяжелых металлов на физиологические параметры растений Материалы и оборудование Чашки Петри, растворы, содержащие ионы Pb, Cu, Zn, Mo, Co, Mn в количествах. 0,1; 1; 10 ПДК; семена ячменя, гороха, редиса.

Ход анализа 1. Поместите в 4 чашки Петри по 13 семян исследуемого растения.

2. Прибавьте в три чашки по 10 мл растворов с различными концентрациями тяжелых металлов (0,1; 1; 10 ПДК). В четвертую чашку добавьте 10 мл дистиллированной воды, она будет служить контролем.

3. Опыт заложите в трехкратной повторности.

4. Оставьте чашки на 6 дней для прорастания семян.

5. Учтите длину корней в проросших семенах в мм. Учитывать необходимо самые длинные корни в каждом из семян. По три проростка в каждой чашке с максимальными отклонениями не учитываются как случайные.

6. Определите средние значения длины корней. Сравните полученные значения в опытных чашках с контрольными.

7. Выводы об устойчивости растения к действию токсиканта оформите в виде таблицы. Для оценки устойчивости растения к токсиканту вводим индекс устойчивости (I уст):

(Iуст) 0,1 ПДК = (L1/Lk) · 100 %, (Iуст) 1 ПДК = (L1/Lk) · 100 %, (Iуст) 10 ПДК = (L1/Lk) · 100 %, где L1, Lk — длина корня проростка при воздействии токсиканта и в контрольном опыте, соответственно.

8. Составить таблицу, отражающую устойчивость данного растения к соответствующим концентрациям предложенных токсикантов.

Контрольные вопросы 1. Способы проникновения токсичных металлов в организм человека.

2. Транспорт тяжелых металлов по организму.

3. Всасывание и выведение элементов тяжелых металлов.

4. Пути детоксикации тяжелых металлов в организме человека.

5. Действие Pb, Hg, Cd и других элементов на жизненно-важные функции организма.

Лабораторная работа № 41 (4 часа) Определение влияния токсичных тяжелых металлов на биохимические параметры растений В качестве биохимического параметра выберем активность фермента сукцинатдегидрогеназы в корнях проростков семян ячменя до и после обработки ионами тяжелых токсичных металлов.

Материалы и оборудование Растворы, содержащие ионы меди, свинца и марганца в количествах 0,1; 1; 10 ПДК, фотоэлектрокалориметр (ФЭК-2), проростки семян ячменя.

Ход работы Метод определения сукцинатдегидрогеназной активности в гомогенатах тканей.

Принцип: Сукцинатдегидрогеназа катализирует реакцию:

сукцинат — фумарат + 2Н.

Метод регистрации ферментативной активности основан на определении скорости падения оптической плотности окисленной формы 2,6-дихлорфенол-индофенолята натрия (2,6-ДХФИФNa) при акцептировании им протонов от сукцината и переходе в восстановленную форму, не имеющую при длине волны 600 нм оптической плотности. Изменение оптической плотности на 1,0 соответствует окислению 60 наномолей сукцината.

Реактивы 1. Фосфатный буфер 0,1М, рН 7,5: 7,8 г NaH2PO4 растворяют приблизительно в 400 мл воды, затем под контролем рН-метра и интенсивном перемешивании раствора на магнитной мешалке добавляют гранулы NaOH до установления значения рН 7,5, после чего доводят объем до 500 мл. Хранить буфер в холодильнике.

2. NaCN (7мг/2мл дистиллированной воды) нейтрализуют НСl 2N до рН 7,0–7,5. Этот реагент применяется для блокады цитохромов, которые без блокирования переносили бы электроны и протоны не на 2,6-ДХФИФNa, а на кислород и тем самым мешали бы определению активности фермента.

3. Феназинметсульфат (ФМС) 0,02М раствор (8мг/2мл дист.

воды). Этот реагент является промежуточным акцептором электронов и протонов и облегчает перенос их на 2,6-ДХФИФNa. Его готовят в день определения активности СДГ и хранят в темной посуде.

4. 2,6-ДХФИФNa — 6мг/10 мл дист. воды. Готовят на неделю работы, хранят в темной посуде. Окисленная его форма имеет синий цвет, при восстановлении становится бесцветной.

5. Сукцинат 0,5М раствор — 590мг/10мл дист. воды, нейтрализовать гранулами гидроксида натрия или калия до рН 7,0–7,5.

6. Гомогенат ткани 1: 10, приготовленный на 0,15 М КСl, свежеприготовленный, хранить в холодильнике при отрицательной температуре.

Техника определения активности фермента Состав инкубационной смеси:

фосфатный буфер 0,1М, рН 7,5.............................................. 0,8 мл NaCN......................................................................................... 0,1 мл ФМС.......................................................................................... 0,1 мл 2,6-ДХФИФNa........................................................................ 0,05 мл гомогенат 1: 10..................................................................... 0,005 мл Реакцию после измерения исходной оптической плотности при длине волны 600 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см запускают сукцинатом 0,05мл Регистрируют время, за которое уменьшится оптическая плотность на 0,1 единицы. Реакцию проводят в термостатируемой кювете при 30 градусах Цельсия (можно и при 26 °С и при 37 °С).

Техника расчета активности сукцинатдегидрогеназы Допустим, что оптическая плотность инкубационной смеси снизилась на 0,1 ед. за 10 секунд, за минуту она уменьшилась бы на 0,1 х 6 = 0,6 ед. Известно, что падение оптической плотности на 1,0 равно окислению 60 нм субстрата. Отсюда по пропорции находим, сколько сукцината окислилось при изменении оптической плотности на 0,6 ед.:

60 нмолей сукцината : 1 = х : 0,из пропорции х = 36 нмолей сукцината х мин –1.

Активность фермента необходимо выразить на белок гомогената, который определяют биуретовым методом.

Принцип метода: при взаимодействии ионов с белками образуется комплекс с пептидными связями, который обладает оптической плотностью при 540 нм. Окраска пропорциональна количеству белка в пределах 2-10 мг белка.

Реактивы 1. Стандартный раствор бычьего сывороточного альбумина, содержащий 10 мг белка в 1мл. 2. Биуретовый реактив: (0,15 г CuSO4 x 5H2O и 0,6 г NaKC4H6O6 натрий-калий виннокислый или сегнетова соль) растворяют в 50 мл дистиллированной воды, при энергичном перемешивании приливают туда 30 мл 10 %-ного рра NaОH (свободного от Na2CO3), добавляют 0,1 г KJ и доводят водой до 100 мл. Хранят в холодильнике.

Техника определения белка в гомогенатах Для построения калибровочного графика берут ряд стеклянных пробирок и подписывают их: 1 — контроль на реактивы; 2 — 0,2 мл стандартного раствора белка (2 мл белка); 3 — 0,4 мл ст. рра б. (4мг); 4 — 0,6 мл ст. р-ра б.(10 мг); 5 — 0,8 ст. р-ра б. (8 мг);

6 — 1 мл ст. р-ра б. (10 мг). В контроль вносят один мл дист. воды, в 2 пробирку + 0,8 мл воды; 3 — 0,6 мл. воды; 4 — 0,2 мл воды;

5— 0 мл воды. Затем во все пробирки вносят по 4 мл биуретового реактива и инкубируют при комнатной температуре 30 мин. Затем фотометрируют при 540 нм в кювете с длиной оптического пути 1см. Из опытных проб вычитают значение контрольной пробы и по изменению Е строят график, откладывая по оси ординат значения оптической плотности, а по оси абсцисс — значения белка в мг. Из графика можно получить коэффициент К (Смг/Е). Для нашего графика он равен 17,8.

Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 || 10 | 11 |   ...   | 19 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.