WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 || 11 | 12 |   ...   | 19 |

При определении белка в гомогенатах поступают следующим образом: в контроль добавляют 1 мл дист. воды, в опытные — по 0,1 мл гомогената 1:10 + 0,9 мл дист. воды. Затем во все пробы — по 4 мл биуретового реактива и далее, как при построении колибровочного графика. Из опытных проб вычитают значение холостой пробы (контроль) и по изменению оптической плотности, которое умножают на коэффициент графика, находят количество белка в мг в пробе.

Допустим, изменение оптической плотности для белка печени при 540 нм равно 0,16. При умножении 0,16 на Кгр (17,8) находим количество белка в 0,1 мл гомогената 1:10 = 2,85 мг.

Определяя активность СДГ, мы вносили 0,005 мл гомогената 1:10, т.е. 0,1: 0,005 = 1/20 часть от 0,1 мл и белок в этой добавке был также в 20 раз меньше (2,85:20 = 0,14 мг).

Расчет активности СДГ лучше вести на 1 мг белка. Для этого составляем пропорцию: за 1 мин СДГ окислила 36 нмоль ЯК и там было 0,14 мг белка, а 1 мг белка окислили бы Х нмоль ЯК.

1• X = = 257,14 нмоль ЯК • мин -1 мг -1 белка.

0,Контрольные вопросы 1. Биохимические функции металлов в организме человека как микроэлементов.

2. Цианиды. Токсикологическая характеристика. Механизм действия.

3. Токсичность и механизм действия некоторых газообразных веществ (СО, NO2, SO2).

4. Фотохимический смог. Токсикологическая характеристика.

Лабораторная работа № 42 (6 часов) Определение влияния токсичных органических жидкостей на физиологические параметры растений Материалы и оборудование Чашки Петри.

Растворы, содержащие растворы бутанола, этиленгликоля, изоамилового спирта в количествах 0,1; 1; 10 ПДК.

Семена ячменя, гороха, редиса.

Ход анализа 1. Поместите в 4 чашки Петри по 13 семян исследуемого растения.

2. Прибавьте в три чашки по 10 мл растворов с различными концентрациями тяжелых металлов (0,1; 1; 10 ПДК). В четвертую чашку добавьте 10 мл дистиллированной воды, она будет служить контролем.

3. Опыт заложите в трехкратной повторности.

4. Оставьте чашки на 6 дней для прорастания семян.

5. Учтите длину корней в проросших семенах в мм. Учитывать необходимо самые длинные корни в каждом из семян. По три проростка в каждой чашке с максимальными отклонениями не учитываются как случайные.

6. Определите средние значения длины корней. Сравните полученные значения в опытных чашках с контрольными.

7. Выводы об устойчивости растения к действию токсиканта оформите в виде таблицы. Для оценки устойчивости растения к токсиканту вводим индекс устойчивости (Iуст):

(Iуст) 0,1 ПДК = (L1/Lk) · 100 %, (Iуст) 1 ПДК = (L1/Lk) · 100 %, (Iуст) 10 ПДК = (L1/Lk) · 100 %, где L1, Lk — длина корня проростка при воздействии токсиканта и в контрольном опыте соответственно.

Контрольные вопросы 1. Основные пути проникновения органических веществ в организм.

2. Токсичные органические жидкости. Дихлорэтан, четыреххлористый углерод и другие.

3. Токсичные спирты. Механизм действия на организм человека метанола.

4. Токсичность этиленгликоля, этанола.

5. Превращения и детоксикация токсичных органических веществ в организме человека.

Лабораторная работа № 43 (6 часов) Определение влияния токсичных органических веществ на биохимические параметры растений В качестве биохимического параметра выберем активность фермента сукцинатдегидрогеназы в корнях проростков семян ячменя до и после обработки токсичными органическими соединениями.

Материалы и оборудование Растворы, содержащие бутанол, дихлорэтан, этиленгликоль, изоамиловый спирт в количествах 0,1; 1; 10 ПДК.

Фотоэлектрокалориметр (ФЭК-2).

Проростки семян ячменя.

Ход работы Метод определения сукцинатдегидрогеназной активности в гомогенатах тканей.

Принцип: Сукцинатдегидрогеназа катализирует реакцию:

сукцинат — фумарат + 2Н.

Метод регистрации ферментативной активности основан на определении скорости падения оптической плотности окисленной формы 2,6-дихлорфенол-индофенолята натрия (2,6-ДХФИФNa) при акцептировании им протонов от сукцината и переходе в восстановленную форму, не имеющую при длине волны 600 нм оптической плотности. Изменение оптической плотности на 1, °Cоответствует окислению 60 наномолей сукцината.

Реактивы 1. Фосфатный буфер 0,1 М, рН 7,5: 7,8 г NaH2PO4 растворяют приблизительно в 400 мл воды, затем под контролем рН-метра и интенсивном перемешивании раствора на магнитной мешалке добавляют гранулы NaOH до установления значения рН 7,5, после чего доводят объем до 500 мл. Хранить буфер в холодильнике.

2. NaCN (7мг/2мл дистиллированной воды) нейтрализуют НСl 2N до рН 7,0–7,5. Этот реагент применяется для блокады цитохромов, которые без блокирования переносили бы электроны и протоны не на 2,6–ДХФИФNa, а на кислород и тем самым мешали бы определению активности фермента.

3. Феназинметсульфат (ФМС) 0,02М раствор (8мг/2мл дист.

воды). Этот реагент является промежуточным акцептором электронов и протонов и облегчает перенос их на 2,6-ДХФИФNa. Его готовят в день определения активности СДГ и хранят в темной посуде.

4. 2,6-ДХФИФNa — 6мг/10 мл дист. воды. Готовят на неделю работы, хранят в темной посуде. Окисленная его форма имеет синий цвет, при восстановлении становится бесцветной.

5. Сукцинат 0,5 М раствор — 590мг/10мл дист. воды, нейтрализовать гранулами гидроксида натрия или калия до рН 7,0–7,5.

6. Гомогенат ткани 1: 10, приготовленный на 0,15 М КСl, свежеприготовленный, хранить в холодильнике при отрицательной температуре.

Техника определения активности фермента Состав инкубационной смеси:

фосфатный буфер 0,1М, рН 7,5.............................................. 0,8 мл NaCN......................................................................................... 0,1 мл ФМС.......................................................................................... 0,1 мл 2,6-ДХФИФNa........................................................................ 0,05 мл гомогенат 1 : 10.................................................................... 0,005 мл Реакцию после измерения исходной оптической плотности при длине волны 600 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см запускают сукцинатом...0,05 мл.

Регистрируют время, за которое уменьшится оптическая плотность на 0,1 единицы. Реакцию проводят в термостатируемой кювете при 30 градусах Цельсия (можно и при 26 ° и при 37 °).

Техника расчета активности сукцинатдегидрогеназы Допустим, что оптическая плотность инкубационной смеси снизилась на 0,1 ед. за 10 секунд, за минуту она уменьшилась бы на 0,1 х 6 = 0,6 ед. Известно, что падение оптической плотности на 1,0 равно окислению 60 нм субстрата. Отсюда по пропорции находим, сколько сукцината окислилось при изменении оптической плотности на 0,6 ед.:

60 нмолей сукцината : 1 = х : 0,из пропорции х = 36 нмолей сукцината х мин –1.

Активность фермента необходимо выразить на белок гомогената, который определяют биуретовым методом.

Принцип метода: при взаимодействии ионов с белками образуется комплекс с пептидными связями, который обладает оптической плотностью при 540 нм. Окраска пропорциональна количеству белка в пределах 2–10 мг белка.

Реактивы 1. Стандартный раствор бычьего сывороточного альбумина, содержащий 10 мг белка в 1 мл. 2. Биуретовый реактив: (0,15 г CuSO4 x 5H2O и 0,6 г NaKC4H6O6 натрий-калий виннокислый или сегнетова соль) растворяют в 50 мл дистиллированной воды, при энергичном перемешивании приливают туда 30 мл 10 %-ного NaОH (свободного от Na2CO3), добавляют 0,1 г KJ и доводят водой до 100 мл. Хранят в холодильнике.

Техника определения белка в гомогенатах 1.Для построения калибровочного графика берут ряд стеклянных пробирок и подписывают их: 1 — контроль на реактивы;

2 — 0,2 мл стандартного раствора белка (2 мл белка); 3 — 0,4 мл ст. р-ра белка (4 мг); 4 — 0,6 мл ст. р-ра белка (10 мг); 5 — 0,8 мл ст. р-ра белка (8 мг); 6 — 1 мл ст. р-ра белка (10 мг). В контроль вносят один мл дист. воды, в 2 пробирку + 0,8 мл воды; 3 — 0,6 мл воды; 4 — 0,2 мл воды; 5 — 0 мл воды. Затем во все пробирки вносят по 4 мл биуретового реактива и инкубируют при комнатной температуре 30 мин. Затем фотометрируют при 540 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см из опытных проб. Вычитают значение контрольной пробы и по изменению Е строят график, откладывая по оси ординат значения оптической плотности, а по оси абсцисс — значения белка в мг. Из графика можно получить коэффициент К (Смг/Е). Для нашего графика он равен 17,8.

При определении белка в гомогенатах поступают следующим образом: в контроль добавляют 1 мл дист. воды, в опытные — по 0,1 мл гомогената 1:10 + 0,9 мл дист. воды, затем — во все пробы — по 4 мл биуретового реактива и далее, как при построении калибровочного графика. Из опытных проб вычитают значение холостой пробы (контроль) и по изменению оптической плотности, которое умножают на коэффициент графика, находят количество белка в мг в пробе.

Допустим, изменение оптической плотности для белка печени при 540 нм равно 0,16. При умножении 0,16 на Кгр (17,8) находим количество белка в 0,1 мл гомогената 1:10 = 2,85 мг.

Определяя активность СДГ, мы вносили 0,005 мл гомогената 1:10, т.е., 0,1: 0,005 = 1/20 часть от 0,1 мл и белок в этой добавке был также в 20 раз меньше (2,85:20 = 0,14 мг).

Расчет активности СДГ лучше вести на 1 мг белка. Для этого составляем пропорцию: за 1 мин СДГ окислила 36 нмоль ЯК и там было 0,14 мг белка, а 1 мг белка окислили бы Х нмоль ЯК.

1• X = = 257,14 нмоль ЯК • мин -1 мг -1 белка.

0,Контрольные вопросы 1. Действие органических веществ на биохимические реакции в организме.

2. Чувствительность и пластичность поведения при воздействии токсичных органических веществ.

3. Хлорорганические соединения. Их токсичность. Механизм действия.

4. Фосфорорганические соединения. Их токсичность. Механизм действия.

5. Ртутьорганические соединения. Токсичность. Механизм действия.

Лабораторная работа № 44 (4 часа) Определение токсичности микроскопических грибов по Н.А.Спесивцевой на простейших (Paramecium caudatum) Метод применяется для исследования экстрактов из чистых культур микромицетов и культуральной жидкости.

Приготовление экстрактов Культуру грибов выращивают на плотных питательных средах (МПА, агар Чапека и др.). Пленку гриба отделяют от среды, помещают в пробирку и заливают нейтральной водопроводной водой в соотношении 1:1, 1:2. Пробирки встряхивают и помещают для экстракции на 24 часа при температуре 4–100 0С.

Нельзя пользоваться физиологическим раствором, так как он вызывает гибель парамеций через 4–5 минут !!! Для исследований можно пользоваться пленками грибов, полученных на агаровых средах в чашках Петри при первичных посевах почвы, кормов и др. При этом необходимо отделять чистые колонии одного вида гриба так, чтобы не попадали элементы другого вида гриба, агар и посевной материал.

Методика постановки опыта На предметное или часовое стекло наносят микропипеткой одну каплю культуры парамеций и 2 капли исследуемого экстракта. Капли должны быть одинаковыми по объему. Контролем служит вода, на которой готовят экстракт. Для предупреждения подсыхания капель стекло помещают в чашку Петри со смоченной в воде ватой или фильтровальной бумагой. Наблюдения ведут в течение 24 ч, просматривая под микроскопом при малом увеличении (7 • 20) первые 10 мин и далее через каждые 30 мин.

Необходимо следить, чтобы воздух в комнате, где проводят исследование, был чистый, так как химические реактивы, сорбируясь с водой, вызывают гибель парамеций.

Учет и оценка результатов Резко токсичные грибы вызывают гибель парамеций в первые 3 мин. При наблюдении в первые секунды отмечают усиленные движения с последующим замедлением, паралич сократительных вакуолей и сильное расширение их, а затем лизис парамеций. Оболочка лопается. Иногда резких изменений не наступает, так как парамеции погибают в первые секунды и быстро разрушаются.

Токсичные грибы — парамеции гибнут через 8–10 мин.

Слаботоксичные грибы — гибель парамеций наступает через 1–3 часа.

Парамеции уменьшаются в размерах, протоплазма становится зернистой, движения парамеций прекращаются и они постепенно лизируются.

Очень слаботоксичные грибы: вызывают гибель парамеций через 16 –24 часа.

Нетоксичные грибы: гибели и каких-либо морфологических изменений у парамеций не вызывают даже при наблюдении за ними в течение 24–48 часов.

Лабораторная работа № 45 (8 часов) Определение токсичности грибов на растениях (по М.И.Саликову и Е.И.Карповой-Бенуа) Культуры грибов выращивают на жидких питательных средах (МПБ, Средах Чапека или Сабуро). После культивирования пленку гриба снимают, тщательно растирают в ступке 30 мин и смешивают опять с культуральной жидкостью. Смесь тщательно взбалтывают и фильтруют через бумажный, а затем через пластинчатый фильтры. В полученную прозрачную светло-желтого цвета жидкость погружают черенками листья различных растений. В качестве наилучшей модели рекомендуются листья одуванчика и манжетки.

В качестве контроля используют воду и стерильную культуральную жидкость.

Учет результатов опыта В зависимости от токсичности исследуемого гриба в различные сроки наступает увядание, края листьев желтеют, а черенки загнивают. Токсины грибов вызывают у растений необратимые явления плазмолиза. Резко токсичные грибы вызывают увядание растений через 2–4 суток. Причем чем моложе листья, тем скорее они увядают.

Метод служит для ориентировочных и предварительных исследований.

Лабораторная работа № 46 (4 часа) Определение токсичности грибов на лягушках Этим методом определяют токсичность чистых культур (пленок гриба и культуральной жидкости).

Техника приготовления экстракта Пленки гриба в пробирках заливают эфиром в соотношении 1:3 и экстрагируют 24-48 часов. После этого эфир выпаривают на водяной бане и подсушивают до плотного состояния, пока он не примет вид воскообразного вещества. Затем его растворяют в 96 %-ном р-ре спирта так, чтобы в 1 мл спирта содержалось 45– 60 мг плотного остатка. Этот раствор смешивают с раствором Рингер-Локка до получения однородной беловатого цвета жидкости.

Минимальные концентрации, действующие на сердце лягушки — 30–35 мг/ %. Этот раствор считается рабочим раствором.

Сердце лягушки изолируют по методу Березина. Запись изменений работы сердца проводят на кимографе. Можно помещать сердце на часовое стекло. Контролем служат вытяжки из атоксичных штаммов гриба и жидкость Рингер-Локка с таким же процентом спирта.

При наличии токсических веществ после введения рабочего раствора через 7–10 мин отмечают изменения в работе сердца.

Экстракты из токсичных штаммов грибов Stachybotrys alternans вызывают сокращения сердечного желудочка с последующей остановкой сердца в систоле.

Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 || 11 | 12 |   ...   | 19 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.