WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

Менее изученными гепарансульфат-протеогликанами являются синдекан-2 (фиброгликан), синдекан-3 (N-синдскан) и синдекан-4 (риудокан, амфигликан). Последнему приписывают внутриклеточную функцию возможного связывания других мембранных белков или цитоскелета.

Более "многоликим" представляется TNPa — полипептид с ММ 17 кДа. Он — медиатор воспаления и играет выдающуюся роль в патогенезе эндотоксического шока, вызванного грамотрицательными бактериями. TNPa стимулирует активность коллагеназы и продукцию простагландина Е2 синовиальными клетками, активность остеокластов и резорбцию костной ткани, способствует ангиогенезу, стимулирует пролиферацию фибробластов, индуцирует высвобождение ИЛ 1 и 6, PDGF. Вместе с тем, он — цитотоксический и цитостатический ингибитор опухолевого роста, вовлекается в патологические процессы типа раковой кахексии, или истощения (от греч. Kakos — плохо, oexis — состояние) и церебральной малярии (отлат.

cerebrum — головной мозг).

Установлено, что убитые клетки Staphylococcus aureus стимулируют продукцию TNFa в культурах мононуклеарных фагоцитов или моноцитов крови человека.

Предварительная обработка клеток бисбензилизохинолиновым алкалоидом тетрандрином подавляет эту продукцию. Поэтому высказано предположение о том, что тетрандрин можно использовать для лечения воспалителъных заболеваний, при которых TNFa играет основную роль.

С добавлением или без добавления фороболов и ростовых факторов клетки опухолей теряют присущий нормальным клеткам фибронектин, округляются и в таком виде продолжают размножаться и существовать в ряду поколений. Привнесение к ним извне фибронектина сопровождается восстановлением их способности к адгезии, но без реверсии в нормальные клетки по физиологобиохимической сущности, то есть они все равно остаются опухолевыми.

Следует отметить, что в культуру давно введены клетки крови, соединительной ткани и другие. Соединительнотканные клетки — фибробласты (от лат. fibra — нить, волокно; от греч.

blastos — почка, росток, отпрыск) характеризуются выраженной адгезивностью благодаря обильной продукции ими фибронектина (см. рис. 152), поэтому их монослойные культуры всегда удаются с определенным успехом.

В искусственных условиях удается культивировать клетки эпидермиса кожи, то есть диплоидные и "продвинутые" в дифференциации клетки. Направленность такой работы, главным образом, практическая и результаты ее бесценны для ожоговых клиник. По сообщению немецких ученых (1988) за —7 недель из кусочка кожи размером 2 см2 можно получить "кожу" размером 1—2 м2. Для этого у пациента, которому предстоит пересадка кожи, берут кожный лоскут и помещают в раствор специальных ферментов, эпидермис отделяется от подлежащих слоев кожи, его промывают и переносят в питательную жидкость. Клетки делятся, а в присутствии стимуляторов их рост еще более ускоряется.

Получение инсектопатогенных вирусов в клеточных культурах. Культуры клеток и тканей насекомых приобрели большое значение в различных биологических науках (эндокринология, биохимия, вирусология и др.) и в биотехнологии. Это стало возможным благодаря разработкам соответствующих сред, на которых хорошо развиваются указанные биообъекты, а на объектах, в свою очередь, можно с успехом поддерживать рост соответствующих патогенов, поражающих растения, животных и человека (паразиты и вирусы). Более того, на культурах клеток и тканей насекомых можно обеспечить продукцию вирулентных инсектовирусов и рекомбинантных белков, используя вирусы насекомых в качестве векторов. В этой связи велика роль таких культур в контроле за чумой, используя биотехнологию.

Прогресс в получении клеточных линий насекомых был последовательно обеспечен трудами В. Трагера в конце 30-х годов текущего столетия, С. Вьятта (1956), Т. Д. С. Грейса (1962).

Грейс модифицировал среду Вьятта, включавшую аминокислоту, пять солей, три сахара, три органические кислоты (рН —6,3—6,5), добавив в нее 9 витаминов комплекса В. В результате ему удалось изолировать 4 культуры, ставшие стабильными линиями клеток насекомых. В последующие годы были получены самые различные клеточные линии от насекомых, относящихся к различным порядкам, но с преобладанием Diptera (мухи, комары) и Lepidoptera — бабочки (от греч. di(s) — два, дважды, двух; pteron — крылышко; lepis —. чешуя). Для них наиболее часто используют среды Дж.

Митсухаси и К. Марамороша (среда ММ), Шилда и Санга (среда МЗ), Шнейдера; Эхальера и Оганесяна (среда D-22), IPL-и другие. Фирма Sigma (США) выпускает указанные среды в сухом виде.

Технология выращивания вирусов на культурах клеток насекомых принципиально мало чем отличается от выращивания других вирусов на клетках животных и человека..

Интерфероны. Интерферон открыт А. Айзексом и Дж.

Линдеманом в 1957 г. в клетках цыпленка, зараженных вирусом гриппа. Это видоспецифическое белковое вещество, синтезируемое лейкоцитами в ответ на воздействие интерфероногенов. Применительно к млекопитающим и, прежде всего, человеку под названием "лейкоциты" объединяют все белые клетки крови (от греч. leikos — белый, kytos — ячейка, клетка) — сегментоядерные лейкоциты (нейтрофильные, эозинофильные, базофильные), или микрофаги, лимфоциты (Т и В) и моноциты. Все эти клетки являются ядерными и участвуют в обеспечении постоянства внутренней среды макроорганизма (гомеостаза), включая неспецифическую и специфическую защиту, или иммунитет.

Однако сегментоядерные лейкоциты относят к разряду полинуклеарных, тогда как моноциты — к разряду мононуклеарных. Мононуклеарными фагоцитами (наравне с моноцитами) являются также гистиоциты, или макрофаги. К ним относят макрофаги соединительной ткани, звездчатые клетки Купфера в печени, альвеолярные макрофаги в легких, свободные и фиксированные макрофаги в лимфоузлах и селезенке, гистиоциты в коже, остеокласты в костной ткани, фиксированные макрофаги в костном мозге, макрофаги в серозных полостях (плевральной и брюшной), макрофаги в нервной ткани (клетки микроглии).

С учетом топологии и/или функции макрофаги подразделяют еще на резидентные, эксудативные (макрофаги воспалительного эксудата), активированные, индуцированные.

Моноциты, макрофаги и их предшественники объединены в так называемую систему мононуклеарных фагоцитов (СМФ).

Генеалогия (от греч. genea — рождение, происхождение, logos — обсуждение) клеток крови изучена достаточно глубоко.

Лейкоциты и другие клетки млекопитающих, в частности, при заражении вирусами продуцируют не один интерферон, а больше, объединяемых в семейство интерферонов, ингибирующих продуктивный цикл репликации вирусов. Вот почему они являются оружием первой линии защиты против вирусных инфекций.

Однако в обычных (неиндуцированных) клетках интерфероны не выявляются. Некоторые характеристики отдельных интерферонов приведены в таблице 3.

Таблица 3 Некоторые характеристики интерферонов человека Тип Характеристики инте клетки - индук- чи_сл локал стаби актив длина ч. амк-т ММ.

нали- рпроду- гено зация чие ность ность сигна в пер- в тор о и- ль- - кДа центы в в хро- нитр при в льной виччо оконичте мосо- онов рН2 прису поспе й чател р- мвх в т- - моле- ьной дова- куле моле- тельн куле стти (ч.амк а лейко- вирус- 14 9 _ да да 23 166 143 циты ная пери- индук- фери- ция, ческой двух- крови нитэва РНК Р фиб- — " — 2 9,2,5 да да 21 166 145 робпа- (5)) сгы 7 лимфо- м ито 1 12 ^ чет нет 20 166 146 ге- циты ны jl| несен- сибил зирова чых фоци- ' тов), специ- фичес.

АГ (санси Билиз ровач- - ные «фоцит ы) Примечание: ДДС — натрия додецилсулъфат; ч. амк-т — число аминокислот, ММ — молекулярная масса в кнлодальтонах; АГ — антигены.

Как следует из таблицы размеры молекул интерферонов близки по числу аминокислот и молекулярной массе, хотя по другим признакам они различны; интерфероны (3 и у являются гликопротеинами, тогда как интерферон а — протеином.

Интерфероны — клеточные белки и поэтому они видоспецифичны, то есть каждому виду животного свойственен свой интерферон, но не являются вирусоспецифическими. При смешанной вирусной инфекции один вирус подавляет другой за счет интерфероногенности первого — феномен вирусной интеференции. Иногда эта видоспецифичность очень узкая, например, для курицы, утки, мыщи и крысы, но не перекрестно в группах птиц и грызунов или между группами. Однако есть исключения — человеческий интерферон защищает клетки крупного рогатого скота лучше, чем коровий интерферон.

Человеческие интерфероны а и р продуцируются преимущественно лейкоцитами, В-лимфобластами и соединительнотканными клетками мезенхимного происхождения — фибробластами в ответ на вирусную инфекцию. Интерферон у прежде называли иммунным, или тип 2; он образуется несенсибилизированными лимфоидными клетками Тлимфобластами в ответ на митогены, и сенсибилизированными лимфоцитами при стимуляции специфическими антигенами (таблица 4).

Т а б л и ц а 4. Виды индуцируемых интерферонов Интерфероны Система индуктор клетки -продуценты вирус лейкоциты периферической лейкоцит арный -а крови — "— лимфобластпый-а В -лим фобласты — "— фибробластный-р фибробласты лейкоциты периферической имунный-у митоген крови или Т-лимфобласты специфический лимфоциты антиген Установлено, что индукторами интерферонов могут быть:

инактивированные температурой или УФЛ вирусы гриппа, реорота и другие вирусы; двухнитевые РНК (например, реовирусная); некоторые полианионные вещества (бактериальные эндотоксины, поликарбоновые кислоты, сополимеры пирана);

синтетические двухнитевые полирибонуклеотиды, например, полиИ: поли Ц —можно достичь супериндукции интерферона, если обрабатывать клетки полиИ: полиЦ вместе с циклогексимидом (ингибитором синтеза белка), а спустя 5 часов — актиномицином Д. Механизмы индукции интерферона до конца еще не изучены и трудно объяснить почему, например, двухнитевые РНК стимулируют образование интерферона, а двухнитевая ДНК не обладает аналогичным действием.

На практике интерферон-а выделяют из лейкоцитов при низкоскоростном центрифугировании свежевыделенной крови человека. Лейкоциты переносят в культуральную среду, содержащую либо сыворотку крови человека или казеин молока, в среду вносят вирус — интерфероноген (вирус Сендай или вирус ныокаслской болезни), выдерживают в течение ночи, после чего лейкоциты отделяют центрифугированием, вирус — интерфероноген инакти-вируют любым из приемлемых способов.

Супернатант (от лат. supernatans — плавающий на поверхности), или надосадок представляет собой нативный интерферон. Его лиофилъно высушивают и выпускают в ампулах.

Это — пористый, серовато-коричневый порошок, легко растворимый в воде. Растворенный препарат имеет розоватокрасноватый цвет и слегка опалесцирует. Из нативного интерферона можно получить концентрированный интерферон путем очистки колоночной хроматографией на сефадексах.

Полученный препарат после высушивания имеет вид пористого порошка серовато-белого цвета, хорошо растворимый в воде. Тот и другой интерфероны должны быть стерильными.

Активность препаратов определяют титрованием на первичных культурах клеток, например, кожно-мышечной ткани эмбриона человека с вирусом везикулярного стоматита. Противовирусная активность (так называемая удельная активность) нативного интерферона должна быть не менее 32 единиц, концентрированного - 100 единиц. Для очистки интерферона можно прибегнуть и к высоко эффективной жидкостной хроматографии.

Интерферон |3 получают из фибробластов, выращенных в монослойной культуре, индуцированной полиИ: полиЦ в присутствии циклогексимида и актиномицина Д. Обычно интерфероны продуцируются в малых количествах (около 1 мг на 10 л тканевой кулътуральной жидкости) и, к тому же, после 48—часов клетки-продуценты отмирают. Вот почему производство лейкоцитарных интерферонов относят к разряду дорогостоящих и экономически — мало выгодных. Поэтому успешно завершившиеся работы по генно-инженерному интерферону помогли решить и эти проблемы.

В начале 80-х годов XX в. британская фирма The Wellcome Foundation LTD передала на клинические испытания природную смесь ct-интерферонов, полученную в глубинной суспензионной культуре вирусоиндуцированных человеческих лимфобластов.

Препарат был назван "велфероном". Выпускается в виде стерильной, прозрачной, бесцветной жидкости по 1 мл (3 мегаединицыМЕ). К 1988 году уже три фирмы выпускали а-интерфероны:

1)выше названный велферон — фирма Wellcome Found., 2)интрон А — фирма Kirby-Warrick, 3)роферон А — фирма Roche.

Интрон А и роферон А являются генно-инженерными препаратами, содержащими лишь один субтип а-интерферона и различающиеся по одной аминокислоте. Так, роферон А обозначается как интерферон а2а; он содержит в полипептидной цепи лизин в позиции 23. Интрон А - это а2Ь-интерферон, содержащий аргинин вместо лизина. Как оказалось, роферон А индуцирует антителообразование примерно у 25% больных, у которых благодаря этому нейтрализуется введенный интерферон.

Технологическая схема получения генно-инженерных интерферонов (как одна из возможных) принципиально сводится к следующему:

1.индукция синтеза и выделение интерфероновой мРНК из клеток, 2.получение кДНК, комплементарной интерфероновой мРНК из лейкоцитов, 3.встраивание кДНК в плазмиду, 4.введение реконструированной плазмиды в клетки Е. coli, 5.размножение бактерий, содержащих реконструированную плазмиду, в культуральной среде, 6.сепарирование клеток Е. coli, 7.дезинтеграция и экстракция клеток Е. coli, 8.осаждение (например, полиэтиленамином) с последующим центрифугированием, 9.высаливание интерферона из супернатанта аммония сульфатом, 10. диализ осадка интерферона, 10.растворение интерферона, пропускание раствора через колонку с иммуносорбентом (пришитыми моноклональными антителами).

11.12. элюция интерферона с последующей хроматографией на целлюлозном катионообменнике.

Из указанных 12 стадий только 8 последних фактически реализуются в производственных условиях, тогда как первые стадии выполняются в лабораторных условиях. Кстати сказать, эти 4 стадии наиболее трудные и сложные.

Бактерии с генами интерферона человека продуцируют специфический белок в количестве 200—250 мкг/л бактериальной суспензии. Кроме Е. coli удается получать человеческий интерферон с помощью Вас. subtilis, способную секретировать синтезируемые белки в окружающую среду (у Е. coli они накапливаются в периплазматическом пространстве), а также с помощью Saccharomyces cerevisiae, растущих на средах с более дешевыми субстратами, на них не действуют фаги, они крупнее бактерий и легче сепарируются, в их клетках осуществляется процессинг преинтерфсронов.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.