WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

В целях репродукции вирусов особую роль сыграли почечные и амниотические зрелые ткани. Из них первые получали от обезъян, вторые — из амниотических оболочек от женщин -рожениц при нормальных родах. Свежие почки от здоровых обезьян, например макаки резус или африканских зеленых мартышек (сразу же после экстирпации, от лат. extirpatio — полное вырезание, вылущение, искоренение) декапсулируют, рассекают пополам, удаляют лоханки, нарезают паренхиматозную ткань на мелкие кусочки, трипси-низируют и клетки (порядка 3x103/мл) помещают в специальную среду, термостатируют при 45°С в качающихся аппаратах. Спустя сутки, культуру заражают, например, вирусом полиомиелита и уже через 4-7 дней в надосадочной жидкости накапливается вирус. Эту жидкость сливают, к ней добавляют формалин до получения 0,025%-й концентрации и смесь оставляют при 37°С на 12 дней для полного обезвреживания вируса. После этого препарат подвергают диализу с последующим контролем на отсутствие живых вирусных частиц, токсичности, безвредности и на активность.

Таков принцип изготовления полиовакцины Дж. Солка.

В случае приготовления живых вакцин из ослабленных (аттенуированных) штаммов вирусов исключают стадию обработки формалином. Так получают, например, живую полиовакцину А. Себина (иммунологических типов 1,11,111). В целях термостабилизации вакцины к ней добавляют химически чистый магния хлорид. Вакцину выпускают в жидком виде (по 5 мл) и в форме конфет-драже. Жидкая форма имеет красновато-оранжевый цвет; цвет драже различен: розовый — для первого иммунологического типа вируса, сиреневый — для второго. типа, голубой — для третьего типа и белый — для смеси всех трех типов.

Кроме полиомиелита специфическую профилактику живыми вакцинами проводят при кори. Противокоревую живую сухую вакцину изготавливают из вакцинного штамма, репродукция которого осуществлялась на клеточных культурах почек морских свинок или фибробластах японских перепелок. Сухая вакцина имеет желтовато-розовый цвет, который может сохраняться после растворения ее в прилагаемом к упаковке растворителе.

Выпускают во флаконах по 1,2,5 и 10 прививочных доз.

После растворения вакцину вводят в количестве 0,5 мл подкожно или по 0,1 мл внутрикожно. Она предназначается для не болевших корью детей в возрасте от 10 месяцев до лет (по показаниям — до 14 лет).

Вакцина против клещевого энцефалита является формолвакциной, полученной из тканевой культуры фибробластов куриного эмбриона и выпускаемом в жидком виде во флаконах (по 10 мл) или ампулах (по 5 мл) с гидроокисью алюминия (до 2 мг) в качестве адсорбента или в лиофильно высушенном виде с желатином (до 1,5%) и сахарозой (до 8%). Вакцину вводят подкожно (жидкую или после разведения в дистиллированной воде сухого препарата).

По способам культивирования особое место занимает вирус бешенства. Его репродукцию осуществляют на мозговой ткани целостных организмов, используя для этого кроликов, крыс, овец. Л. Пастер в 80-е годы XIX века выделил от больной собаки вирус бешенства, и после ряда его пассажей через мозг кроликов он добился того, что вирус приобрел свойства вызывать заболевание у данных животных после определенного и постоянного инкубационного периода (4-6 дней). Такой вирус, в отличие от вируса "уличного" бешенства, получил название Virus fixe (фиксированный вирус). Его-то и применяют для получения вакцин.

В целях профилактики бешенства используют сухие антирабические вакцины Ферми и МИВП. Первую из них готовят из мозга овец возраста до 1 года, вторую — из мозга сосунков белых крыс (возраст 4-8 суток) после заражения тех и других фиксированным вирусом бешенства.

Подобные вакцины представляют собой суспензии мозговых тканей, содержащих указанный вирус. В сухом виде вакцины выпускают в форме таблеток беловато-серого цвета, которые суспендируют в прилагаемом растворителе (дистиллированная вода) и сразу же вводят подкожно.

Хранение разведенных вакцин впрок запрещается.

Вакцина против краснухи содержит живой ослабленный (аттенуированный, от лат. attenuare — уменьшать) вирус, репродуцировавшийся на диплоидных клетках человека или на клетках почек кролика. Используют для профилактики краснухи.

Клетки амниона человека должны быть получены не позднее 12 часов после родов. Для этого послед помещают в стерильный контейнер без применения антисептиков и в ближайшие после этого часы отделяют амнион от хориона, промывают специальным солевым раствором и дважды последовательно трипсинизируют. После этого клетки центрифугируют — в течение 10 минут, ресуспендируют осадок в среде и подсчитывают образовавшиеся изолированные клетки (необходимо получить порядка 106 клеток в 1 мл). Их суспендируют и переносят в большие емкости до получения клеток в 1 мл питательной среды, сменяя ее каждые 5-7 дней.

Полученные клетки можно использовать для культивирования вирусов.

Перевиваемые опухоли животных, в частности, асцитные, нашли широкое применение на практике. Они хорошо растут в форме суспензии изолированных клеток в экссудате брюшной полости, например, мышей и крыс.

Опухолевые клетки размножаются в асцитической жидкости, которую отсасывают из брюшной полости с помощью шприца (или с помощью пипетки после оперативного вмешательства).

Такие клетки можно также выращивать in vitro.

Перевиваемые опухоли животных представляют определенную ценность при изучении противоопухолевых химиотерапевтических веществ. Для выращивания опухолевых клеток могут оказаться полезными так называемые кокарциногены — вещества, индуцирующие формирование опухолевой ткани, хотя сами не являются карциногенами.

Среди известных кокарциногенов наиболее сильным триггерным действием (от англ, trigger — спусковой крючок, "собачка") обладает тиглиан — природный вторичный метаболит у растений, относящихся.к семействам -Euphorbiaceae (молочайные) и Thymelaeaceae (тимиановые). Он является природным (Ьоооболом из rovmrbT тетрациклических дитерпенов с пергидроциклопропабензазуленовым скелетом. В этом скелете содержится 7 хиральных атомов углерода, и, следовательно, возможно существование большого числа изомеров. Из всех фороболов только производные 4(3-форобола являются активными, но не производные 4сс стереоизомеров.

Предполагают, что их деградация происходит замедленно и поэтому они могут непрерывно активировать фермент протеинкиназу С. Это, в свою очередь, стимулирует специфические протеазы, катализирующие реакцию распада фермента с последующим серьезным нарушением клеточной регуляции, сопровождающейся индукцией опухолевого роста.

Необходимо также помнить, что фороболы еще стимулируют клеточную пролиферацию, митогенез лимфоцитов, продукцию простагландинов, дегрануляцию нейтрофилов, синтез ДНК, изменения в свойствах мембран и др. Однако в связи с высокой биологической активностью, эфиры форобола представляют определенную опасность для здоровья работающих с ними лиц. Поэтому операторы должны надевать перчатки, защитные очки и прочую одежду, чтобы защитить кожу и глаза от контакта с этими веществами.

Для инактивации эфиров форобола их необходимо растворить в органическом растворителе, смешивающимся с водой, в равном объеме 10% водного раствора натрия гидроксида. Гидролиз эфиров завершается в срок до одного часа выдержки, после чего щелочной раствор становится безопасным.

Водные растворы эфиров форбола могут быть обезврежены добавлением около 10 % по объему натрия гипохлорита.

Способствует росту опухолевых клеток (-)-индолактам, являющийся производным индола. Его эффективность в других биологических системах различна, что может быть объяснено различным аффинитетом к С-подтипам протеинкиназы; стереоизомер (+ )-ин-долактам не обладает стимулирующим действием, но его можно использовать в качестве субстанции для негативного контроля.

В таком же плане могут быть использованы новые, человеческого происхождения, гормоноподобные ростовые факторы: инсу-лино-подобные (IGF 1 и 2), тромбоцитарные (PDGF, от англ. Platelet Derived-Growth-Factors), трансформирующие ростовые (TGFa и (3), некроза опухолей (TNFa).

IGF I — полипептид, состоящий из 70 аминокислотных остатков, спирально закрученный и удерживаемый в таком состоянии благодаря трем S-S — мостикам между остатками цистеина (рис. 157). Первый из них соединяет дисульфидной связью 6-й и 48-й остатки, второй— 18-йи 61-й остатки, третий — 47-й и 52-й остатки. IGF 1 является пептидным гормоном, влияющим на рост и обмен веществ организма после рождения. Его секреция находится под влиянием уровня гормонов роста в сыворотке крови и характера питания ребенка. IGF 1 влияет на рост и дифференциацию многих типов животных клеток, включая мышиные клетки — предшественники эритроцитов последней стадии и эпителиальные клетки млекопитающих, крысиные миобласты, олигодендроциты, клетки черепа и клетки зобной железы; человеческие хондроциты и адренергические нейробластные клетки. Вариантом IGF является укороченный на N- терминальный трипептид-мозговой 1GF, изолированный из мозга плода и взрослого человека. Этот пептидный гормон важен для роста и метаболизма центральной нервной системы. Он в 4 раза сильнее IGF 1 по стимуляции синтеза в фетальных мозговых клетках крыс и более выраженно реагирует в перекрестных реакциях с рецепторами для IGF 1 на мембранах мозга у плода и взрослого человека.

IGF 2 — полипептид, состоящий из 67 аминокислот (ММ- 470). Как и IGF 1 является сильным митогеном для многих клеток. Как полагают, он — важный регулятор роста соматических клеток, стимулирующий их размножение.

Тромбоцитарный ростовый фактор PDGF - гомодимерный, мульти функциональный полипептид, который действует как сильный митоген в отношении широкого набора эндотёлиальных клеток фибробластов. Его рассматрвают как вещество, играющее важную роль в восстановлении тканей и воспалении. PDGF — хемоаттрактант для фибробластов, гладко мышечных клеток, моноцитов и нейтрофилов, что играет немаловажную роль в заживлении ран.

В отвечающих на PDGF клетках индуцируются оборот фосфатидилинозита, метаболизм простагландинов и активируются фосфолипазы. В человеческих фибробластах кожи, стимулированных PDGF, возрастает в три раза коллагеназная активность. Полагают, что он принимает участие в трансформации клеток и вовлекается в процесс атеросклероза.

Следует отличать PDGF от фактора активации тромбоцитов (PAF, от англ, platelet activating factor) — это фосфолипид, образуемый тромбоцитами, макрофагами, иейтрофилами и эозинофилами под влиянием воспалительного стимула.

Он синтезируется из клеточных мембран под влиянием фосфолипазы А 2 вначале в форме предшественника — lysoPAr, который затем превращается в PAF под влиянием ацетилтрансферазы (этот же энзим катализирует реакцию обратной трансформации PAF в lyso-PAF).

РАН — исключительно потентная субстанция. Она индуцирует агрегацию тромбоцитов, будучи в фемтомолярных концентрациях (1015). После парентерального введения или вдыхания PAF вызывает бронхоспазм и повышенную проницаемость микрокапилляров; количество кровяных пластинок и нейтрофилов в крови падает при одновременном клеточном скоплении в легких. Введенный внутрикожно он вызывает формирование пустулы и повышение температуры при устойчивой клеточной инфильтрации. PAF обладает сильным хемотаксическим эффектом, вызывая накопление нейтрофилов и эозинофилов, активирует их в плане образования других воспалительных компонентов (супероксидных анионов О2 и эйкозаноидов).

С20Н41СООМ; СН^- СН-=СН- СН2- СН= СН -СН2- СН=СНэйкозанкарбоновая СН2 НООС- (СН2)3~ СН кислота =СН эикозантетраен-5,8,1 1,14-овая кислота (арахидоновая кислота) Ингалированный PAF повышает экскрецию лейкотриенов с мочой, возможно потому, что он стимулирует повышенное накопление их в легких как медиаторов воспаления.

Лейкотриены ранее называли "медленно реагирующими субстанциями" при анафилаксии (SPS-A).

TGF — гормоноподобные вещества, которые могут индуцировать временный неопластический рост и дифференциацию нормальных клеток. Фибробласты в среде с TGF не нуждаются затем в субстрате для роста и не отвечают на межклеточные контакты. После удаления TGF из культуральной среды клетки возвращаются к нормальному росту.

TGFa близко родственен эпидермальному ростовому фактору (EGF) благодаря обладанию тем же клеточным рецептором.

TGFa — одиночный полипептид, содержащий аминокислотных остатков; он взаимодействует с тем же рецептором, что и EGF и проявляет такую же потенцию в индуцировании тирозин-киназной активности, связанной с EGFрецептором. TGFa, в отличие от EGF, "запускает" эмбриогенез и активацию протоонкогенеза в течение регенерации поврежденных тканей.

TGF(3 — кислотостойкий полипептид, состоящий из двух идентичных субъединиц со 112 аминокислотами в каждой. Его ММ-25 кДа; изолированы TGFp — 1 и 2 с 71% гомологией между ними и сходной функциональной активностью. В частности, TGFp играет важную роль в генезе опухолей, развитии эмбриона, тканевой репарации и иммунорегуляции.

TGFfJ — ингибитор роста для большинства типов клеток, но может стимулировать образование внеклеточных матриксных белков типа фибронектина и коллагена. TGFa и Р выступают синергистами при трансформации различных клеточных линий.

В регуляции поведения клеток важную роль отводят семейству из четырех синдеканов, являющихся поверхностными протеогли-канами клеток. Из них более детально изучен синдекан- 1. В его так называемом внешнем домене, или эктодомене содержатся ковалентно связанные цепи гликозаминогликанов, состоящие преимущественно из гепарансульфата, а также из хондроитинсульфата. Синдекан - селективно связывает различные внеклеточные матриксные молекулы через его гепарансулъфатные цепи. Одновременно он может связывать ростовые факторы и выступать вектором сайта стимуляции роста; здесь (в месте взаимодействия синдекана-1 с матриксом) иммобилизуется рецепторный комплекс для тирозинкиназы.

Плазматические клетки и ряд человеческих В-клеточных опухолевых линий экспрессируют синдекан-преимущественно в виде гепарансульфат-протеогликана.

Способность В-клеточных линий связывать фибронектин и фибриллярные коллагеновые матрицы четко коррелирует с их экспрессией синдекана-1 на клеточной поверхности.

Экспрессия этого протеогликана также сопряжена с пролиферацией клеток и, как предполагают, с малигнизацией их (от лат. malignus — злокачественный).

Кроме стимуляции роста синдекан-1 также участвует в регуляции морфологии клетки благодаря содействию организации элементов цитосколета, прежде всего, эпителиальных клеток.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.