WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Если же используют клеточные линии (а не первичные клетки), то плотность инокулята может быть несколько меньшей, так как они почти все 100% адгезируются на поверхности культиватора. Покачивание или вращение омываемых средой клеток несомненно сказывается на их прикреплении.

Глубинное выращивание клеток в суспензионных культурах. Площадь выращиваемых клеток можно существенно увеличить при использовании микроносителей, суспендируемых в питательной среде и на поверхности которых клетки закрепляются, а затем разрастаются в виде монослоя. Такие суспендированные микроносители с клетками моделируют глубинные культуры, например, микроорганизмов. Следовательно, в таких системах совмещаются монослойные и суспензионные культуры животных клеток.

В качестве микроносителей применяют положительно заряженные ДЕАЕ-сефадексы, сефадексы с коллагеновым покрытием, отрицательно заряженный полистирол, полые стеклянные сферы и др. Так, например, отдельные фирмы предлагают микросферы из пористого шлачного. стекла (рис. 154), которые могут быть использованы для иммобилизации клеток млекопитающих. Поры их доступны для пенетрации (от лат, penetratio — проникновение) клеток внутрь матрикса, облегчая трехмерную колонизацию внутренней поверхности носителя, что способствует взаимодействию метаболизируюгцих соседствующих клеток и поддержанию их возросших жизнеспособности и продуктивности. Пористые сферы пригодны для иммобилизации прилипающих и суспензионных клеток (например, гибридом).

Рекомендуемый размер сферических микроносителей порядка 200+ 25 мкм оценивают оптимальным с удельной плотностью 1,03. Требуемое количество их примерно равно 104 мл, а для инокуляции необходимо порядка 105 клеток.

При увеличении количества микроносителя возрастает доза клеток в инокуляте.

Подход к выбору сред и контролируемого параметра культивирования остается прежним. Клетки после выращивания отделяют от микроносителей центрифугированием (в том числе — в градиенте плотности), фильтрованием, или, чаще, обработкой трипсином с последующими промыванием и сепарированием.

Суспензионные клетки на микроносителях применяют в целях получения вирусных вакцин (против бешенства, полиомиелита, ящура), Возможности переноса генетической информации из эукариотических клеток в прокариотические сняло проблему массового культивирования животных клеток для получения таких продуктов, как интерферон, гормоны, лимфокины и другие. Здесь успешно развивается рДНКбиотехнология.

Клеткам животных в глубинных культурах почти во всех случаях требуется защитная матрица, - функцию которой берут на себя белки сыворотки крови, добавляемой в среду культивирования. Этим еще раз подтверждается более высокая ранимость животных клеток по сравнению с микробными и растительными клетками. Тем не менее, основные подходы к выбору оборудования и к реализации биотехнологических процессов с использованием животных клеток во многом аналогичны с таковыми в микробной биотехнологии. Например, системы культивирования в обоих случаях могут быть хемо- или турбидостатными, циклическими, непрерывными или полунепрерывными.

В противоположность суспензионным культурам клеток на микроносителях разработаны способы инкапсулирования их в полимерные сферы (полилизиновые, агарозные, из полимерных смол), когда клетки, no-существу, не испытывают того механического напряжения, которое они должны проявлять в свободном виде. Эти способы оказались выгодными для культивирования гибридом в целях получения моноклональных антител. Диаметр микрокапсул, размер пор в них и их толщина могут быть независимо проконтролированы в процессе изготовления и оптимизированы для конкретного типа гибридом. Например, согласно данным фирмы Damon Biotech (Германия) гибридомные клетки человека или животных вначале суспендируют в биосовместимом растворе натрия альгината. Образовавшиеся капельки затем пропускают в раствор кальция хлорида, где они становятся желированными микросферами. На поверхности таких сфер затем формируют полилизиновую мембрану. После этого гель разжижают, оставляя гибридомные клетки в нормальном физиологическом состоянии внутри "дырчатых" микросфер.

В процессе культивирования таких инкапсулированных гибридом продукция моноклональных антител возрастает в сотни-тысячи раз по сравнению с обычным культивированием гибридомных клеток. После завершения биосинтеза антител микрокапсулы подвергают диализу для удаления примесных веществ, а затем физически их "раскрывают", гибридомные клетки и фрагменты капсул легко сепарируются от искомых моноклональных антител, которые могут быть подвергнуты дальнейшей очистке или использованы по назначению. Схема описанных процедур представлена на рис. 155.

Полилизиновая мембрана обеспечивает диффузию небольших молекул питательных веществ внутрь микросфер, но не позволяет выходить иммунным глобулинам.

Кроме физического удаления полилизированной мембраны можно воспользоваться ферментативным гидролизом.

В описанные микросферы можно инкапсулировать не только клетки, но и ферменты, индукторы каких-либо процессов, а также мультисистемы.

Таким образом, глубинное выращивание животных клеток реализуют в трех вариантах:

1)монослой клеток статичен, культуральная среда подвижна;

2)среда культивирования статична, монослой клеток подвижен;

3)клетки (например, на микроносителях, в микросферах) и среда культивирования подвижны.

4)Эти варианты выращивания клеток должны приниматься в расчет при выборе или проектировании соответствующего оборудования.

Другие способы выращивания клеток. В настоящее время в опытно-промышленных условиях получают интерферон, выращивая лимфобласты человека в виде отъемно-доливных культур, то есть когда определенная часть клеточной суспензии замещается свежей средой, например, ultroser HY (Германия), а остающаяся часть "старой" культуры выполняет роль инокулята.

Интерфероны можно получать в периодической культуре, когда часть ее отбирают через определенные интервалы времени при непрерывной подпитке свежей питательной средой и при постоянной скорости ее подачи. Тогда объем культуры прогрессивно возрастает, равно как прогрессивно снижаются скорости ее роста и разбавления.

Как бы долго не удавалось поддерживать клетки в циклических культурах с подпиткой, в конечном итоге они погибают и весь цикл приходится начинать сначала.

Неопределенно длительное время можно выращивать клетки млекопитающих в непрерывных хемостатных культурах, когда удается добиваться постоянства концентрации лимитирующего субстрата и плотности клеток.

Теория и практика непрерывного культивирования впервые сформулированы в 1950 г. Ж. Моно, и, независимо от него, А. Новиком и Л. Сцилардом, предложившими термин "хемостат". В хемостатах скорость подачи свежей среды и отбора культуры равны (как и объем их). Скорость роста, развития и размножения клеток контролируется скоростью подвода лимитирующего компонента, а численность — его концентрацией. В качестве лимитирующего рост агента чаще всего используют глюкозу, реже — фосфат и другие вещества.

При правильном подборе условий выращивания в хемостатах удается на порядок увеличить выход клеток по сравнению с периодическим культивированием. Причем, хемостатные культуры отличаются накоплением физиологически однотипных клеток. Это можно показать на примере с клетками лейкемии мышей — L 1210 (таблица 55), которые засевали (инокулят) в концентрации 2x10s клеток/мл для периодического культивирования, длившегося 3 суток до получения максимальной плотности 2,5x10б клеток/мл (суспензионные культуры). При хемостатном культивировании скорость подачи среды и отъема культуры составляла 0,3 сут~1.

Таблица 2. Накопление клеток L 1210 при периодическом и непрерывном культивировании (по М. Ж. Тови, 1985) Способ Объем Урожайность клеток выращинания среды, л на 1 мл на 1 мг глюкозы в неделю среды х 106 мкг х 10s Периодический 0,3 3,5 524 2,3 1,38 -10" Непрерывный 0,3 6,2 601 6,2 1,12*(хе мо статный) Естественно, что время, затрачиваемое на подготовку смежных циклов и их реализацию при периодическом культивировании, является непроизводительным.

Эмбриональные и другие ткани для репродукции вирусов и получения вирусных вакцин. Из эмбриональных тканей наиболее широко используемыми являются эмбриональные ткани цыпленка, мыши и человека.

Особенной выгодой отличаются куриные эмбрионы (по доступности) десяти-двенадцатисуточного возраста, используемые преимущественно для репродукции вирусов и последующего изготовления вирусных вакцин.

Куриные эмбрионы впервые введены в вирусологическую практику в 1931 г. Г. М. Вудруфом и Е. У.

Гудпасчером. Такие эмбрионы рекомендуют также для выявления, идентификации и определения инфицирующей дозы вирусов, для получения антигенных препаратов, применяемых в серологических реакциях.

Инкубированные при 38°С куриные яйца овоскопируют (просвечивают), отбраковывают, "прозрачные" неоплодотворенные экземпляры и сохраняют оплодотворенные, в которых хорошо видны наполненные кровеносные сосуды хорионаллантоисной оболочки и движения эмбрионов.

Заражение эмбрионов можно проводить вручную и автоматизированно. Последний способ применяют в крупномасштабном производстве, например, противогриппозных вакцин. Материал, содержащий вирусы, вводят с помощью шприца (батареи шприцов) в различные части эмбриона (эмбрионов) (рис. 156).

Все этапы работы с куриными эмбрионами после овоскопии проводят в асептичных условиях. Материалом для заражения могут быть суспензия растертой мозговой ткани (применительно к вирусу бешенства), печени, селезенки, почек (применительно к хламидиям орнитоза) и т. д. В целях деконтаминации вирусного материала от бактерий или в целях предотвращения его бактериального загрязнения можно использовать соответствующие антибиотики, например, пенициллин с каким-либо аминогликозидом порядка 150 МЕ на 1 мл суспензии вирусологического материала.

Для борьбы с грибковым заражением эмбрионов целесообразно воспользоваться некоторыми антибиотиками-полиенами (нистатин, амфотерицин В) или отдельными производными бензимидазола (например дактарин и др.).

Чаще всего суспензию вирусного материала вводят в аллантоисную полость или, реже, на хори он аллантоисную оболочку в количестве 0,05-0,1 мл, прокалывая продезинфицированную скорлупу (например, иодированным этанолом) на расчетную глубину. После этого отверстие закрывают расплавленным парафином и эмбрионы помещают в термостат, в котором поддерживается оптимальная температура для репродукции вируса, например 36- 37,5°С.

Продолжительность инкубации зависит от типа и активности вируса. Обычно через 2-4 суток можно наблюдать изменение оболочек с последующей гибелью эмбрионов.

Зараженные эмбрионы контролируют ежедневно 1-раза (овоскопируют, поворачивают другой стороной).

Погибшие эмбрионы затем передают в отделение сбора вирусного материала. Там их дезинфицируют, аллантоисную жидкость с вирусом отсасывают и переносят в стерильные емкости. Инактивацию вирусов при определенной температуре проводят обычно с помощью формалина, фонола или других веществ.

Применяя высокоскоростное центрифугирование 18 т. или афинную хроматографию, удается получать высокоочищенные вирусные частицы.

Собранный вирусный материал, прошедший соответствующий контроль, подвергают лиофильной сушке.

Контролю подлежат следующие показатели: стерильность, безвредность и специфическая активность. Применительно к стерильности имеют в виду отсутствие: живого гомологичного вируса в убитой вакцине, бактерий и грибов. Безвредность и специфическую активность оценивают на. животных и только после этого вакцину разрешают испытывать на волонтерах или добровольцах; после успешного проведения клинической апробации вакцину разрешают применять в широкой медицинской практике.

На куриных эмбрионах получают, например, живую противогриппозную вакцину. Она предназначается для интраназального введения (лицам старше 16 лет и детям от до 15 лет). Вакцина представляет собой высушенную аллантоисную жидкость, взятую от зараженных вирусом куриных эмбрионов. Тип вируса подбирают согласно эпидемиологической ситуации и прогнозам. Поэтому препараты могут выпускаться в виде моновакцины или дивакцины (например,, включающая вирусы А2 и Б) в ампулах с 20 и 8 прививочными дозами для соответствующих групп населения. Высушенная масса в ампулах обычно имеет светложелтый цвет, который сохраняется и после растворения содержимого ампулы в прокипяченой остуженной воде.

Живые противогриппозные вакцины для взрослых и детей готовят и для приема через рот. Такие вакцины представляют собой специальные вакцинные штаммы, репродукция которых происходила в течение 5-15 пассажей (не менее и не более) на культуре почечной ткани куриных эмбрионов. Их выпускают в сухом виде во флаконах. При растворении в воде цвет из светло-желтого переходит в красноватый.

Из других вирусных вакцин, получаемых на куриных эмбрионах, можно назвать против on аротитную, против желтой лихорадки.

Из прочих эмбриональных тканей используют эмбрионы мышей или других млекопитающих животных, а также абортированные плоды человека., Эмбриональные перевиваемые ткани доступны после обработки трипсином, поскольку в таких тканях еще не формируется большого количества межклеточных веществ (в том числе небелковой природы). Клетки разделяются и после необходимых обработок их культивируют в специальных средах в монослое или в суспендированном состоянии.

Ткани, изолируемые от животных после рождения, относятся к разряду зрелых. Чем их возраст больше, тем с большим трудом они культивируются. Однако после успешного выращивания они затем "выравниваются" и мало чем отличаются от эмбриональных клеток.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.