WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Для проведения адаптации был выбран ступенчатый режим увеличения концентрации тяжёлой воды в ростовых средах, так как мы предположили, что постепенное привыкание организма к тяжёлой воде будет оказывать благоприятный эффект на скорость роста культуры. При этом штамм М. flagellatum обнаружил повышенную чувствительность к тяжёлой воде: ингибирование роста бактерий наблюдалось при концентрациях D2О в среде 74,5 об.%. Роста бактерий на более высокой концентрации тяжёлой воды достичь не удалось. В связи с этим, в экспериментах по изучению уровней включения дейтерия в аминокислоты использовали препараты культуральной жидкости и биомассы М. flagellatum, полученные со среды, содержащей 74,5 об.% тяжёлой воды. Концентрация экзогенного дейтерометанола CD3OD составляла, как обычно, 1 об.%.

Адаптация факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum. Попытки адаптировать штамм В. methylicum к росту при сохранении способности к биосинтезу L-фенилаланина на максимально дейтерированной среде привели к желаемому результату. К данному штамму метилотрофных бактерий был применён специально разработанный нами подход по адаптации, который заключался в серии из пяти адаптационных пассажей исходной культуры на агаризованных средах (с добавкой 2 об. % дейтерометанолом CD3OD) при ступенчатом увеличении концентраций экзогенной тяжёлой воды (от 0; 24,5;

49,0; 73,5 об% до 98 об% D2O) и последующей селекции устойчивых к тяжёлой воде клонов бактерий. При этом последовательно отбирали отдельные колонии, выросшие на средах, содержащих тяжёлую воду. Затем их пересевали на среды с большей степенью дейтерированпости, включая среду с об.% тяжёлой водой (степень выживаемости бактерий на конечной полностью дейтерированной среде составляет не более 40%).

Полученный результат в опытах по адаптации В. methylicum к тяжёлой воде, позволил использовать гидролизаты его биомассы, а также саму биомассу, полученную в ходе многоступенчатой адаптации к D2O в качестве полноценных ростовых субстратов для выращивания бациллярных штаммов В.

subtillis и В. amytoliquefaciens, а также штамма галофильных бактерий Н. halobium ET1001.

Адаптация бацилл В. subtittis и В. amyloliqucfaciens. В следующих опытах была исследована способность к росту на тяжёлой воде бациллярных штаммов В. subtillis (his, tyr, ade, иrа), и В.

amyloliquefaciens (ade, иrа), продуцентов инозина и тимидина, соответственно. Мы предположили, что замедление роста бактерий на минимальных средах, содержащих тяжёлую воду могло быть обусловлено появлением ауксотрофности по отдельным ростовым факторам. Чтобы проверить это предположение, в дальнейшем мы использовали комплексные среды. Как и предполагалось, обе культуры удалось адаптировать к дейтерию путём рассева на твёрдые среды, приготовленные из 99,9 ат.% тяжёлой воды.

Они сразу обнаружили нормальный рост на тяжёлой воде. У штаммов В. subtilis и В. amyloliquefaciens при росте на тяжёлой воде было отмечено сохранение высокого уровня продукции по инозину и тимидину (3,9 и 3,0 г/л соответственно).

Адаптация галофильных бактерий Н. halobium ET 1001. В случае с Н. halobium ET 1001 адаптацию проводили как на агаре, содержащим 99,9 ат.% тяжёлую воду путём рассева штамма до отдельных колоний, так и на жидкой среде с тяжёлой водой. В обычных для этой бактерии условиях культивирования (37°С, на свету) в клетках синтезировался фиолетовый пигмент по всем характеристикам не отличающийся от нативного бактериородопсина.

2. ИЗУЧЕНИЕ РОСТА И БИОСИНТЕЗА БАС ПОЛУЧЕННЫМИ ШТАММАМИ Изучение ростовых характеристик М. jlagellatum на средах, содержащих CH3OH/CD3OD и D2O, а также СНзОН. Данные по росту штамма М. Jlagellatum на минимальных средах с добавкой 1 об.% метанола СНзОН и его меченных аналогов (СDзOD/13СНзОН) и содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды приведены в таблице I. Как видно из таблицы I, на средах, содержащих тяжёлую воду и изотопные аналоги метанола – дейтеро-метанол CD3OD и 13Сметанол 13CH3OH, выходы микробной биомассы составили 81% и 72% соответственно, а на средах с 74,об.% тяжёлой водой выход биомассы составил 29%, что в 3,4 раза ниже, чем в контрольных экспериментах, когда использовали обычную воду и метанол СНзОН (табл. 1, опыты 1,3,8). Как видно, способность к росту у М. flagellatum сохранялась лишь в среде, содержащей 74,5 об.% тяжёлой воды. Выше этой концентрации наблюдалось ингибирование скорости роста бактерий.

Таблица 1. Влияние изотопного состава среды на рост штамма M.flagelaum.

Номер Компоненты среды, об% Величина Выход Время опыта лаг-фазы биомассы генерации Н2О D2O СНзОН 1 99,0 0 1,0 0 0 100 1,2 99,0 0 0,5 0,5 0,2 91,0 0,3 99,0 0 0 1,0 0,8 81,0 1,4 49,5 49,5 1,0 0 2,4 76,0 1,5 49,5 49,5 0,5 0,5 5,7 75,0 1,6 49,5 49,5 0 1,0 6,7 70,0 1,7 24,5 74,5 1,0 0 5,6 29,0 1,8 99,0 0 0 0,1 72,0 1,1,'ЗСНзО Как и следует из литературных данных (Складнее Д. А, 1990), введение стабильного изотопа углерода |С не приводит к летальным последствиям для клетки, что мы и наблюдали в случае с М. flage/talum. В целом, полученные для М. flagellatum данные могут свидетельствовать о том, что адаптация к тяжёлой воде определяется как видовой специфичностью метилотрофных бактерий, так и особенностями их метаболизма. Кроме этого, из таблицы 1 следует, что данный подход можно эффективно использовать для введения в синтезируемые БАС двойной изотопной метки (дейтерий- и изотоп углерода 15C).

Изучение ростовых и биосинтетических характеристик Б. methylicum на средах, содержащих CH3OH/CD3OD и D2O. Данные по росту исходного и адаптированного к тяжёлой воде штамма В.

methylicum и максимальному уровню накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости на минимальных средах с добавкой 2 об.% метанола и его дейтерированного аналога СН3OН/CD3OD, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды, представлены в таблице 2. Как видно из табл. 2, в отсутствии дейтерий-меченных субстратов продолжительность лаг-фазы не превышала 24 ч (см. табл. 2, опыт 1). С увеличением концентрации тяжёлой воды в среде продолжительность лаг-фазы увеличивалась до 64,4 ч на средах с 98 об.% тяжелой водой и 2 об.% CD3OD (табл. 2, опыт 10). Отмечено, что длительность времени клеточной генерации с увеличением степени изотопного насыщения среды дейтерием постепенно увеличивается, достигая 4,9 часов на максимально дейтерированной среде (табл. 2, опыт 10).

Таблица 2.

Влияние изотопного состава среды на рост штамма В. mehylicum и уровень накопления Lфенилаланина в культуральной жидкости*.

Номер Компоненты среды, об% лаг-фаза Выход Время Выход опыта биомассы генер. L-Phe, Н2 О D2O СH3ОН CD3OD ч 1 98 0 2 0 24,0 100 2,2 2 98 0 0 2 30,3 92,3 2,4 99, 3 73,5 24,5 2 0 32,1 90,6 2,4 96,4 73,5 24,5 0 2 34,7 85,9 2,6 97,5 49,0 49,0 2 0 40,5 70,1 3,0 98,6 49,0 49,0 0 2 44,2 60,5 3,2 98,7 24,5 73,5 2 0 45,8 56,4 3,5 90,8 24,5 73,5 0 2 49,0 47,2 3,8 87,9 0 98,0 2 0 60,5 32,9 4,4 79,10 0 98,0 0 2 64,4 30,1 4,9 71,10' 0 98,0 0 2 39,9 87,2 2,9 95,'Данные (1-10) приведены для В. methylicum, не адаптированного к средам с высоким содержанием дейтерия.

Данные 10' приведены для адаптированного В. methylicum.

Как видно из табл. 2, опыт 2, дейтерометанол CD3OD не вызывал существенного ингибирования роста и не оказывал влияния на выход микробной биомассы, в то время как на средах с 98 об.% тяжёлой водой микробный рост подавлялся. Так, на среде, содержащей 98 об.% тяжёлой воды и 2 об.% дейтерометанола СDзОD, выход микробной биомассы был снижен в 3,3 раза no-сравнению с контролем. Важно то, что выход микробной биомассы и уровень накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости при росте адаптированного к тяжёлой воде штамма В. inethylicum в полностью дейтерированной среде изменяются по сравнению с контрольными условиями на 12,8% и 5% соответственно (табл. 2, опыт 10').

За счёт использования данного штамма В. methylicum удалось выделить порядка 1 г L-Phe из 1 л среды.

Исследование биосинтеза L-фенилаланина штаммом В. methylicum. Общей особенностью биосинтеза L-Phe в протонированных средах было значительное увеличение его продукции на ранней фазе экспоненциального роста В. inethylicum, когда выход микробной биомассы был незначителен (рис. I).

Рис. I. Динамики роста В. methylicum (la, 10'а, 10а) и накопления L-Phe в культуральной жидкости (16, 10'б, 106) на средах с различным изотопным составом: 1 а,б - исходный микроорганизм на протоннрованной среде М9; 10' а,б адаптированный В. methylicum на полностью дейтерированной среде; 10 а,б - еадаптированный микроорганизм на полностью дейтерированной среде.

Во всех изотопных экспериментах наблюдалось ингибирование биосинтеза L-фенилаланина на поздней фазе экспоненциального роста и снижение его концентрации в ростовых средах. Согласно данным по микроскопическому исследованию растущей популяции микроорганизмов, наблюдаемый характер динамики секреции L-Phe не коррелировал с качественными изменениями ростовых характеристик культуры на различных стадиях роста, что служило подтверждением морфологической однородности микробной популяции. Скорее всего, накопленный в процессе роста фенилаланин ингибировал ферменты собственного пути биосинтеза. Кроме того, мы не исключаем возможность, что при ферментации без рН-статирования может происходить обратное превращение экзогенного фенилаланина в интермедиаторные соединения его биосинтеза, что отмечено в работах других авторов (Ворошилова Э. Б., Гусятипер М. М., 1989). Данные по исследованию культуральной жидкости методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) показали, что кроме L-фенилаланина данный штамм В. methylicum синтезирует и накапливает в культуральной жидкости другие аминокислоты (аланин, валин, лейцин, изолейцин), четко детектируемые масс-спектрометрическим анализом (см. след, главу).

Изучение качественного и количественного состава внутриклеточных сахаров В. subtilis. В ходе выполнения работы был изучен качественный и количественный состав внутриклеточных Сахаров при росте В. subtilis на среде с 99,9 ат.% тяжёлой воды (см. табл. 3). Как видно из таблицы 3, в гидролизатах биомассы данного штамма фиксируются глюкоза, фруктоза, рамноза, арабиноза, сахароза и мальтоза.

Таблица 3.

Качественный и количественный состав внутриклеточных Сахаров В. subtilis при росте на 99,9 %тяжёлой воде.

Компонент Содержание в биомассе, % Рост на Н2О Рост на 99,9% D2O Глюкоза 20,01 21,Фруктоза 6,12 6,Рамноза 2,91 3,арабиноза 3,26 3,мальтоза 15,30 11,сахароза 8,62 - Изучение аминокислотного состава биомассы метилотрофных бактерий В. tnethylicum.

Аминокислотный состав суммарных белков биомассы В. methylicum, полученного в ходе многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде показан в таблице 4. Результаты исследования показали небольшое снижение содержания в дейтерированном белке Ala, Leu и Нis по сравнению с белком, полученным на обычной воде (табл. 4).

Таблица 4.

Качественный и количественный состав аминокислот общих белков биомассы В. methylicum.

Аминокислота Содержание в белке, % Рост на Н2О Рост на 98% D2O Gly 8,03 9,Ala 12,95 13,Val 3,54 3,Leu 8,62 7,His 4,14 3,Phe 3,88 3,Tyr 1,56 1,Asp 7,88 9,Glu 11,68 10,Lys 4,37 3,His 3,43 3,Thr 4,81 5,Met 4,94 2,Arg 4,67 5,Изучение ростовых и биосинтетических характеристик В. subtilis на средах, содержащих тяжёлую воду и гидролизаты метилотрофных бактерий. Кривые, отражающие динамику роста, ассимиляции глюкозы и накопление инозина в культуральной жидкости штаммом В. subtilis в условиях протонированной среды и среды, с 99,9 ат.% тяжёлой воды представлены на рис. 2.

Как видно из рис. 2, при переносе клеток со стандартной на дейтерированную среду выход микробной биомассы, продолжительность лаг-фазы и длительность времени клеточной генерации в целом изменяются незначительно. При росте исходного штамма В. subtilis па среде, содержащей обычную воду уровень накопления инозина в культуральной жидкости достигал величины 17,3 г/л после пяти суток культивирования (рис. 2). Уровень накопления инозина на дейтерированной среде был снижен в 4,4 раза по-сравнению с исходным штаммом на протонированной среде (рис. 2). Низкие уровни секреции инозина на дейтерированной среде коррелируют со степенью конверсии глюкозы в этих условиях. Так, кривая конверсии глюкозы на полностью дейтерированной среде имела меньший угол наклона, чем на среде с обычной водой, что свидетельствует о том, что при росте на дейтерированной глюкоза расходуется менее эффективно (рис. 2).

Рис.2. Динамики роста B.subtilis (1a, 2a), конверсии глюкозы (1б,2б) и накопления инозина в культуральной жидкости (1в,2в) на средах с различным изотопным составом: 1 а,б,в-B. Subtilis на обычной протонированной среде; 2 а,б,в-B.subtilis на полностью дейтерированной среде с гидролизатом дейтеро-биомассы метилотрофных бактерий.

Полученные для исследуемых микроорганизмов данные, в целом, подтверждают устойчивое представление о том, что адаптация клетки к тяжёлой воде является фенотипическим явлением, поскольку адаптированные к тяжёлой воде клетки возвращаются к нормальному росту и биосинтезу в протонированных средах после некоторого лаг-периода. В то же время обратимость роста на D2O/H2Ocpeдax теоретически не исключает возможности того, что этот признак стабильно сохраняется при росте в тяжёлой воде, но маскируется при переносе клеток на дейтерированную среду. Можно предположить, что клетка реализует лабильные адаптивные механизмы, которые способствуют функциональной реорганизации работы ферментных систем в тяжёлой воде. Также не исключено, что наблюдаемые при адаптации эффекты связаны с образованием в тяжёлой воде более прочных и стабильных связей, чем связей с участием водорода. По теории абсолютных скоростей разрыв С-Н-связей может происходить быстрее, чем C-D-связей, подвижность дейтерия D+ меньше, чем подвижность протия Н+, константа ионизации D2O в раз меньше константы ионизации Н2О (Crespy J., Kalz H.H., 1979). С точки зрения физиологии, наиболее чувствительными к замене протия на дейтерий могут оказаться аппарат биосинтеза макромолекул и дыхательная цепь, т. е. именно те клеточные системы, которые используют высокую подвижность протонов и высокую скорость разрыва водородных связей.

3. ИЗУЧЕНИЕ СТЕПЕНЕЙ ВКЛЮЧЕНИЯ ИЗОТОПОВ ДЕЙТЕРИЯ и УГЛЕРОДА 13С в МОЛЕКУЛЫ ЭКЗОГЕННЫХ АМИНОКИСЛОТ B. methylicum и М. flagellatum.

Получение препаратов культуральных жидкостей, содержащих экзогенные дейтерий - и Саминокислоты. Дейтерий-меченные аминокислоты были выделены в составе препаратов лиофилизованных интактных культуральных жидкостей, свободных от белков и полисахаридов, при росте штамма В.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.