WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 ||

При упаривании различных растворителей получают осадок или кристаллы витамина, которые растворяют в соответствующем растворителе до нужной концентрации.

Выход витамина B12 при использовании пропиоиовокислых бактерий - 25—40 мг/л. Но есть патентное сообщение (Франция) о достижении невероятно высокого выхода — 216 мг/л.

Получение витамина В12 с помощью бактерии Pseudomonas denitrificans Ряд штаммов рода Pseudomonas образует в значительных количествах Bia, но чаще всего используют мутант Ps.

denitriflcans, у которого в результате мутагенеза уровень витамина В12 удалось поднять с 0,6 мг/л (дикий штамм) до мг/л. Бактерии культивируют с аэрацией и перемешиванием в периодических (или проточных) условиях в среде (а) следующего состава: свеклосахарная меласса — 100 г, дрожжевой экстракт — 2 г, (NHtb НРО4 — 5 г, MgS04 — 3 г, MnS04 — 200 мг, CoNO3 — 188 мг, 5,6 ДМБ — 25 мг, ZnSO4 — 20 мг, Na2MoO3 — 5 мг, вода водопроводная — до л, рН 7,4. Меласса богата бетаином и глутаминовой кислотой, оказывающими положительный эффект на выход витамина. Бетаин стимулирует синтез б-АЛК и, возможно, также изменяет проницаемость мембраны.

Культуру сохраняют в лиофилизированном состоянии, поддерживают в вышеприведенной среде. Пересев осуществляют в пробирку с плотной средой (б). Состав среды (б): свеклосахарная меласса — 60 г, пивные дрожжи — 1 г, N—Z-амин — 1 г, (МН4ЬНРО4 — 2 г, MgSO4 - 1 г, MnSO4 -- 200 мг, ZnS04 -20 мг, MoSO4 — 5 мг, агар — 25 г, вода водопроводная — до 1 л, рН 7,4. Инкубируют 4 дня при 28°. Далее клетки переносят в 150 мл жидкой среды того же состава (но без агара), налитую в литровую колбу Эрленмейера. Инкубируют 3 дня при 28° на качалке.

Содержимое колбы вносят в ферментер на 5 л, содержащий 3,3 л среды (см. выше), стерилизованный 75 мин при 120°.

Инкубируют 90 ч при 29° с перемешиванием (420 об/мин) и аэрацией (0,2 м3/ч). Чистый витамин В12 получают в результате проведения следующих последовательных операций:

Культуральная жидкость с клетками Ps. denitrificans (3,3л) нагревание 30 мин при 20°С, охлаждение, доведение рН до 8,5, добавление KCN, перемешивание 16 ч при 25°, добавление ZnCl2 (200 г), доведение рН до 8,0, перемешивание, фильтрация крезола и углеродистого тетрахлорида (1 : 2 — соотношение) Фильтрат трехкратная Органический экстракция 350 экстракт I мл смесей Водный экстракт Трёхкратная экстракция 30 мл. смеси крезола и углеродистого тетрахлорида (1:2 соотношения) Органический экстракт II Добавление 200 мл ацетона и 120 мл эфира Неочищенный витамин ВВ результате процесса экстракции получают цианкобаламин 98%-й чистоты и выходом 75%. Конечный выход — 59—мг/л, CN-кобаламин — стабильная форма витамина.

Получение витамина B12 с помощью метаногенных бактерий В клетках метанобразующих бактерий витамин Вприсутствует от 4,1 нмоля/мг сухих клеток у Methanosarcina barkeri до 0,65 наномолей/мг сухих клеток у Metanobacterium formicum. Биосинтез кобаламинов архебактериями (изучали на М. barkei) сходен с биосинтезом корриноидов у анаэробных эубактерий. У метанотрофа Mtb.

thermoautotrophicum большая часть клеточного кобамида локализована во фракции мембран и связана с мембранным белком. Предполагают, что содержащий кобамид интегральный мембранный белковый комплекс играет существенную роль в метаболизме этих бактерий при утилизации H2 + CO2, которая, видимо, сводится к переносу электронов. Корриноиды у метанобразующих бактерий участвуют также в катаболизме ацетата и метанола.

Превращение метанола в метан у Mis. barkeri происходит через образование СНз-СоМ, в метилировании которого за счет метанола участвуют две метилтрансферазы, зависимые от кобамида. Корриноид, видимо, служит простетической группой фермента.

Во Франции из ила сточных вод выделили мезофильные метаногенные бактерии и инкубировали их в ассоциации с другими бактериями в полупроточном режиме в среде, содержащей метанол (3—12 г/л), мелассу, кукурузный экстракт, NH4, Co, ортоксилидин и 5,6 ДМБ. Ферментацию ведут при 35° в ферментере на 1000 м3 с ежесуточной заменой 10% бродящего субстрата свежей средой. Биомассу отделяют на сепараторах и высушивают на распылительной сушилке. Высушенный концентрат усредняют мелом до стандартной активности 1000 мкг/г препарата, который используют в таком виде как добавку к кормам. Сухой концентрат до усреднения содержит —3000 мкг/г витамина B12 что составляет 45—50% суммы корриноидов, фактор III - 10—15% и другие неполные корриноиды — 40—50%.

Термофильные штаммы метанотрофных бактерий родов Methanobacillus и Methanobacterium образуют 2 мг/л кобаламина при содержании в среде 8 г/л метанола.

В России производство кормового препарата витамина Bосновано в основном на переработке барды (отхода ацетоно-бутилового или спиртового производства) биоценозом бактерий, осуществляющих термофильное метановое брожение сточных вод.

Используют сложный консорциум анаэробных микроорганизмов, включающих углеводсбраживающие, аммонифицирующие, сульфатвосстанавливающие и метанобразующие бактерии. К, барде добавляют метанол — до 2%, СоСl2-6Н2О — 10 г/м3, мочевину - 300 г/м3 и сухие кормовые дрожжи — 230 г/м3. Дозировку обогатителей производят автоматически.

Барду подают в нижнюю часть ферментатора метантенка (па 4—5 тыс. м3), в котором автоматически регулируют параметры процесса, обеспечивая контроль температуры (55—57°С), рН (7,5—8,0) и длительности брожения. Брожение ведут непрерывно, ежесуточно заменяя 20—25% бродящей жидкости на свежую барду. В качестве пеногасителя используют рыбий жир.

Для получения кормового препарата бражку выпаривают и сушат. Поскольку витамин В!2 неустойчив при тепловой обработке, особенно в щелочной среде, его стабилизируют.

Для этого получаемую в процессе брожения жидкость перед выпариванием подкисляют до рН 5,0—5,3 и добавляют к ней сульфит натрия (0,1—0,25%). Содержание витамина В12 в исходной сброженной жидкости — 4,4 г/м3. Сгущение сброженной барды осуществляют на выпарных аппаратах (до 14—17% содержания сухих веществ), а сушку в распылительной сушилке. Концентрация витамина Bi2 в высушенном препарате — 500—600 мг/кг. Истинный витамин составляет 20—25% от суммы корриноидов, фактор III — 35—40%, фактор В и другие — 40—45%. Получаемый препарат называют КМБ-12.

Мезофильные и термофильные метаногенные бактерии, в том числе Metanobacterium thermoautotrophi-сит, Mb.

thermoformicuin, Mb. bryantii, Metanosarcina barkeri, Ms.

vacuolata, Ms. mazei, Methanococcus hatopilus, синтезируют исключительно фактор III.

Истинный витамин B12 образуют неспорообразующие метилотрофы: Eubacterium limosum, близкий к нему Butyribacterium methylotrophicum и Acetobacter woodi. Путем создания искусственных биоценозов и подбора условий ферментации возможно целенаправленное регулирование процесса биосинтеза витамина В12.

Новые разработки. Для удешевления производства витамина B12 и утилизации дешевого возобновляемого сырья изучалось образование корриноидов бактериями Prop, atidipropionici ATCC 25562 при росте на ксилозе как главной составной части гидролизатов гемицеллюлоз. Используя ксилозу, бактерии аккумулировали 0,35 мг корриноидов в одном литре среды без внесения солей Со. Для продукции корриноидов из ксилозы больше всего подходит UFR-реактор, работающий с ультрафильтрационной рециркуляцией клеток.

Иммобилизованные клетки. В Японии сразнивали стабильность и продуктивность биокатализатора при включении клеток Propionibacterium sp. в гели каппакаррагенана, Na-альгината, агара и форполимерные уретановые смолы. Оптимальной подложкой служит форполимер PU-9, полимерная матрица которой не снижала активности включенных в нее клеток. В оптимальных условиях ферментации 5 г иммобилизованных клеток вновь синтезировали и экскретировалн 900 мкг витамина за 18 дней повторной периодической ферментации, продемонстрировав возможность проведения многоступенчатого сложного синтеза (подобных примеров известно немного).

Усовершенствование штаммов-продуцентов. В последние годы усовершенствование штаммов было достигнуто путем мутаций и селекции. Этим методом в 50 раз увеличена продуктивность по витамину у Ps. denitrificans. Для грамположительных бактерий Propionibac-terium, Bacillus, Streptotnyces применимо слияние протопластов, для грамотрицательных бактерий, например Pseudomonas, доступны конъюгативные плазмиды, как Inc PI. Пока весомых практических результатов этими новыми и мощными методами не получено, но начало таким работам положено. Клонировали 11 генов, кодирующих ферменты биосинтеза витамина B12 у бактерии Вас. megaterium.

Полагают, что в геноме содержится всего 20—30 таких генов. Поэтому DNA Вас. megaterium подвергли фрагментированию и крупные фрагменты встраивали в плазмиды, которыми далее трансформировали мутантыауксотрофы по В12. Такие мутанты приобрели способность синтезировать витамин В12. Метод может быть использован для получения штаммов-продуцентов в производственных масштабах.

В бактерии Е. coll клонированы гены Prop, technicum, ответственные за синтез витамина В12. Бактерия Prop.

technicum не содержит плазмид, поэтому из этого штамма выделили, очистили и частично разрушили ДНК, получив фрагменты 15—20 килобаз. Эти фрагменты включили в расщепленную плазмиду pBR 322 и полученной гибридной плазмидой трансформировали Е. соli. Новые трансформанты отличались от контрольного штамма в отношении морфологических и физиологических признаков.

ЛИТЕРАТУРА Быховский В. Я. Микробиологический синтез витамина Bi2.

Сер. V. М., 1984.

Быховский В. Я., Панцхава Е. С. Промышленное получение витамина Bia методом метанового брожения.

Пущино, 1983.

Воробьева Л. И. Микробиологический синтез витаминов.

М., 1982.

Письменный В. В., Зыбин Н. С. и др. Автоматизация процессов производства кормового концентрата витамина B12 ВНИИСЭНТИ. 1985. Сер. IX.

Поморцсва Н. В. Перспективы получения витаминов и коферментов с помощью микроорганизмов//Химикофармацевтический журнал. 1986. № 8. С. 965—976.

Jeter R., Е s с а 1 а п t е - S e m е г е n a J. С. et al. Synthesis and use of vitamin Bi2//Escherichia coli and Salmonella typhimurium. 1987. Vol. 1. P. 551—556.

Kami kubo T, et al. Biological activities of new corrinoids//Agr.

Biol. Chem. 1982. Vol. 46(6). P. 1673—1677.

La go B. D., K, a 1 a n L. Vitamin fermentations: B2 and B12. Adv.

Biotechnol// //Proc. 6 Int. Perm. Symp. London, 1980. Vol. 3.

P. 241—246.

Yongsmith В., Sonomoto K. et al. Production of vitamin Biby immobilized cells of Propionic acid bacteria//Eur. J. Appl.

Micr. Biotechnol. 1982. Vol. 16. P. 70—74.

Pages:     | 1 ||



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.