WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Разработаны векторные системы на основе растительных хлоропластов и митохондрий, ДНК которых имеют гомологичные области с ядерной ДНК, что облегчает обмен участками между ними при выполнении генноинженерных экспериментов.

Заманчивы в качестве векторных систем и транспозоны. Их множество сулит многообещающие результаты в опытах с однодольными растениями, устойчивыми к заражению агробактериями и, следовательно, к восприятию Т-ДНК Ti-плазмиды.

В качестве векторов могут также использоваться вирусы растений. Их нуклеиновые кислоты реплицируются и проявляют свои функциональные свойства (экспрессируют) в клетках растений-хозяев, где потенциал вирусов и воспринимающих клеток объединяется и реализуется в приумножении организованных частиц патогена (например, для вируса мозаики табака в среднем 107 частиц на клетку, для вируса мозаики цветной капусты — порядка 104 частиц на клетку).

Однако вирусы как векторы обладают четырьмя существенными недостатками: они патогенны, их емкость небольшая, вирусы не способны встраиваться в хромосомы растительных клеток, они, в основном, видоспецифичны, то есть поражают определенный круг растений — хозяев.

В качестве векторов могут быть использованы также и вироиды (см.), представляющие собой однонитевые цепи ковалентно связанных кольцевых РНК, включающих 270— 300 нуклеотидов, лишенных оболочки. Вироиды поражают виноград, картофель, кокосовую пальму, томаты и другие растения как по вертикали (через зародышевые клетки), так и по горизонтали (распространяются по растительному организму через клеточный сок или переносятся механически).

Чтобы использовать вирусную (вироидную) РНК в качестве вектора, необходимо выполнить следующие последовательные операции.

Рис. Последовательнсть событий при использовании вирусной (вироидной) РНК в качестве вектора: 1 — обратная транскриптаза, 2 — ДНК-полимераза, 3 — встраивание в плазмиду(клонирование), 4 — включение чужеродного гена, 5 — инфицирование растений, 6 — транскрибирование с образованием инфекционной РНК и последующее заражение растения-хозяина.

Клон кДНК с встроенным геном может обладать инфекционностью и, как следствие, им заражают хозяйское растение. Если же кДНК с встроенным геном не обладает инфекционностью, то вирусный вектор может быть транскрибирован с образованием РНК, которая затем используется для заражения растения.

До сих пор ученые признают, что векторная система на основе цитоплазматического вируса мозаики цветной капусты (содержит двух-цепочечную ДНК) оказывается наиболее приемлемой в генно-инженерных экспериментах с растениями, хотя многое здесь остается неизученным (например, молекулярные механизмы проявления симптомов заболевания растения-хозяина от поражения вирусом, неопределенность диапазона растений-хозяев и возможность его расширения, неспособность векторной системы встраиваться в геном хозяина, и др.).

Если удается объединить возможности ДНК из вируса мозаики цветной капусты с Т-ДНК Ti-плазмиды, то такую векторную систему можно будет использовать на более широком круге растений-хозяев.

Объединение геномов клеток разных особей можно осуществлять при половой и соматической гибридизации.

Первая из них способна реализоваться в природных и искусственных условиях, тогда как вторая — только в искусственных. Половая гибридизация давно известна человеку, и он с тех пор использовал ее для выявления новых сортов растений и для повышения их продуктивности.

Соматическая гибридизация базируется в основном на применении растительных протопластов, впервые полученных Дж. Клеркером в 1892 г. из листьев Stratiotes aloides (водное растение, именуемое телорезом).

Соматические клетки растений, как и интактные клетки бактерий или грибов (по лат. intactus -- нетронутый), в обычных условиях не сливаются друг с другом. Все они предварительно должны быть лишены клеточной стенки я трансформированы в протопласты.

Протопласты (от греч. protos — первый, plastos — вылепленный, образованный) — это клетки, лишенные клеточных стенок, способные сохраняться и метаболизировать, равно как и реконструировать клеточную стенку в подходящих условиях. Протопласты можно получать с помощью механических и биохимических (энзиматических) методов. В первых случаях добиваются плазмолиза растительных тканей, например, с помощью 0,1% раствора сахарозы с последующим разрезанием эпидермиса и освобождением протопластов в окружающую питательную среду. Энзиматические методы по-разному эффективны в получении протопластов. Здесь необходимо подбирать ферменты для каждого вида растений, однако наиболее часто используют целлюлазы, пектиназы, гемицеллюлазы как индивидуально, так и в комбинациях.

Например, для получения протопластов из листьев Nicotiana tabacum листовую ткань без эпидермиса погружают в смесь ферментов, включающую 0,5% пектиназы и 2% целлюлазы в 0,7 М растворе маннита или сорбита; для получения протопластов из листьев клевера и люцерны используют 2— 5% смесь гликаназ с пептидазами, и т. д.

В сравнительном плане более подходящим является энзиматический метод получения протопластов как более щадящий. Однако при любом способе важен подбор осмотического стабилизатора, без которого может наступить быстрый плазмоптиз протопластов (по лат. plasma — плазма, option — альтернатива). В качестве таких стабилизаторов могут быть применены растворы неорганических солей (СаС12, КС1, NaHPO4), органических гликолей (маннита, сорбита), моно- и дисахаридов (глюкозы, ксилозы, сахарозы) в ориентировочных концентрациях 0,3—0,8 М/л. Однако применительно к виду растения, из которого получают протопласты, необходимо подбирать индивидуальные условия для "протопластирования" (осмотический стабилизатор, рН среды, ГС). Эти требования сохраняются и в случаях получения протопластов из каллусных культур и клеточных суспензий.

В жизнеспособности выделенных протопластов большую роль играет физиологическая полноценность исходного растительного материала. Суспензионные культуры наиболее приемлемы для этих целей, будучи в конце логарифмической фазы роста (размножения).

Полученные тем или иным путем протопласты либо используют для регенерации растения, либо их можно подвергнуть слиянию с образованием гетерокариотических гибридов.

Из растений, относительно легко регенерирующих из протопластов, можно назвать картофель, люцерну, маниок, рапс, табак. Для получения растений — регенерантов, высаженных в грунт, требуется, как минимум, 16—18 недель.

Растения, полученные из протопластов, могут отличаться достаточно выраженной изменчивостью по ряду интересующих нас признаков: урожайности, величине (размеру), морфологии отдельных частей, фотопериодичности и др. Как правило, это связывают с изменением числа и перестройками хромосом. Поэтому протопласты растений представляют собой интересные объекты и для изучения процессов мутагенеза.

Гибридизация протопластов удается не только в тех случаях, когда исходные растения (источники клеток для протопластирования) способны гибридизоваться половым путем, но и тогда, когда заведомо известно, что клетки, подлежащие слиянию, относятдя к организмам с половой несовместимостью. Тем не менее, во всех случаях соматической гибридизации один из партнеров должен нести какой-либо маркерный признак (биохимический или другой), по которому возможно подтвердить достоверность получения гибрида. В этом смысле удобны ауксотрофные мутанты.

Гетерокариотические соматические гибриды выделяют либо вручную с помощью микроманипулятора, капиллярной пипетки и шприца, либо автоматически на основе применения флуоресцентных систем.

Для биотехнологии также важна цибридизация, когда возникают гетерозиготы по внеядерным (цитоплазматическим) генам, определяющим, например, устойчивость к гербицидам или признак цитоплазматической мужской стерильности (рисунок).

К настоящему времени из ряда растительных протопластов получены их безъядерные фрагменты — микропласты, окруженные тонопластной мембраной и включающие часть внеядерного генетического материала.

Используя приемы соматической гибридизации, микропласты можно сливать с реципиентными протопластами. Таким образом, микропласты являются резервным материалом для расширения возможностей клеточной инженерии в фитобиотехнологии. Более того, теперь удается гибридизация растительных протопластов с протопластами микроорганизмов и животными клетками.

Применительно к хромосомной инженерии удалось доказать проникновение изолированных метафазных хромосом в обработанные полиэтиленгликолем реципиентные протопласты таких однодольных растений, как пшеница и кукуруза.

Также открываются пути привнесения дополнительной генетической информации по желанию экспериментатора в целях создания трансгенных растений. Прямой перенос чужеродной ДНК в протопласты возможен также с помощью микроинъекции, трансформации, упаковки в липосомы с последующим их эндоцитозом растительными протопластами, и электропорации (высоковольтных электрических импульсов).

Другая отрасль фитобиотехнологии - это создание растений, способных фиксировать атмосферный азот.

Азотистые удобрения, вносимые в почву (наряду с другими питательными веществами) стимулируют рост и развитие растений. Обогащению почвы азотом помогают особые микроорганизмы, фиксирующие молекулярный азот из воздуха. Такие микробы подразделяют на две группы — свободноживущие в почве (например, Azotobacter chroococcum) и микробы - симбионты с корневой системой растений (например, Rhizobium meliloti). Те и другие осуществляют биологическую азотофиксацию. Число азотофиксаторов невелико, но от них в буквальном смысле слова зависит жизнь на нашей планете. С помощью микробов - азотофиксаторов ежегодно фиксируется около 17,5 x 107 тонн азота из воздуха. Основные компоненты системы азотофиксации являются сильными восстановителями: ферментный комплекс — нитрогеназа, ферредоксин или флаводоксин и АТФ. Микробы — азотофиксаторы трансформируют молекулярный азот в аммиак по следующей схеме:

Ассоциация клубеньковых бактерий из рода Rhizobium с бобовыми растениями является наиболее эффективной по фиксации N2 из воздуха. Ответственными за это являются nif-гены. Соответствующие биопрепараты бактериальных удобрений выпускают в различных странах мира.

К настоящему времени практически решена проблема увеличения nif-генов в микробах — азотофиксаторах, являющихся симбионтами донника (Rh. meliloti). За счет этого заметно усиливается азотофиксация и, как следствие, повышается урожайность растения — хозяина (схема).

Схема получения клеток Rhizobium meliloti, несущих дополнительные гены азотфиксации: 1 — плазмидная ДНК, 2 — рестриктаза, 3 — клетка Rh.meliloti, 4 — хромосома клетки, 5 — nif-гены, 6 —лигаза, 7 — рестриктирован-ная плазмидная ДНК, 8 — плазмидная ДНК с nif-геном, 9 — трансформация, 10 — клетка Rh.meliloti с nif-генами.

В настоящее время имеются также предпосылки к созданию методами генной инженерии злаковых растений — азотофиксаторов. Это сулит большие выгоды агрохозяйствам, занимающимся выращиванием, например, зерновых культур.

Прибегают и к простым искусственным ассоциациям азотофиксирующих бактерий с растениями, дающими ощутимые результаты по урожайности (например, цианобактерии Anaboena variabilis и табака).

В начале 90-х годов текущего столетия удалось создать подсолнечник, несущий гены бобов фасоли, кодирующих белок фазеолин. Такое химерное растение получило название "Санбин" (от англ, sun — солнце, bean — боб), оно способно синтезировать во многом полноценные белки. Каллусная культура санбина также обладает этой способностью.

Кроме генов фазеолина локализованы и выделены гены таких запасаемых белков, как зеин — белок кукурузы и легумин — белок гороха. Эти гены удается переносить в отдельные негомологичные растения.

Создан трансгенный рапс, содержащий гены отдельных нейропетидов человека, например, лейэпкефалина, связанного с геном альбумина семян рапса. С одного гектара земли, засеянного таким рапсом, можно получать до 3 кг неиропептида.

Важное значение имеют работы по созданию гербицидоустойчивых растений, не боящихся сорняков.

Удалось перенести из представителей актиномицетов ген устойчивости к фосфаноцину в клетки сахарной свеклы;

получены также устойчивые к гербицидам определенные сорта табака.

Токсические белковые кристаллы, образующиеся в клетках Вас. thuringiensis на основе матричного синтеза, убивают личинок лис то грызущих насекомых. Поэтому генноинженерная разработка по переносу гена бактериального токсина в геном табака увенчалась успехом в 1987 г.

Экспрессия такого гена сопровождалась биосинтезом токсина, и личинки насекомых, поедающие листья, погибали в сравнительно короткий промежуток времени. По такому же принципу был создан инсектицидный трансгенный хлопчатник, содержащий ген ингибитора трипсина гороха коровьего; этот ген обусловливает синтез белка, блокирующего протеолитическую активность в пищеварительной системе у насекомых.

Создан новый сорт помидоров, длительно сохраняющийся без размягчения вследствие подавления активности фермента полигалактуронидазы. Методом генной инженерии получен ген, определяющий биосинтез анти-мРНК, которая ингибирует природную мРНК.

Благодаря удачному переносу генов фермента халькосинтетазы в петунию удалось получить растение с белыми цветами.

Сконструированы такие генноинженерные сорта сои, которые проявляют устойчивость к насекомым, гербицидам, вирусам и образуют больше запасных белков, обогащенных метионином.

В настоящее время на основе методов геномной инженерии получены межвидовые гибриды капусты, картофеля и табака с турнепсом, картофеля с помидором ("Помат"), помидора дикого вида, устойчивого к некоторым вирусам, и культурного сорта.

Весьма успешными оказались работы по созданию морозоустойчивых растений на основе их обработки культурой клеток Pseudomonas syringae, из которой элиминирован ген, ответственный за синтез специального белка, ускоряющего кристаллизацию воды с образованием льда. Обработка клубней картофеля таким "ледминус" микробом приводит к возрастанию их морозоустойчивости.

ЛИТЕРАТУРА Бациллы. Генетика и биотехнология. Под ред. К.

Харвуда. М., Мир, 1992.

Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, в 2-х частях. М., Мир, 1989.

Бекер М. Е., Лиепиньш Г. К., Райпулис Е. П.

Биотехнология, М., ВО Агропромиздат, 1990.

Биотехнология в 8-ми томах. Под ред. Н. С. Егорова, В.

Д. Самуилова. Уч. пособие для вузов. М., Высшая школа, —1988.

Биотехнология: принципы и применение. Под ред. И.

Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса. М., Мир, 1988, Биотехнология растений. Под ред. С. X. Мантелла и X.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.