WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

И все же микрокультивирование исключительно заманчиво не только на пути создания большого количества безвирусного'материала, но и массовости получения образцов в относительно короткие сроки (несколько тысяч в течение месяцев).

Микрокультивирование in vitro обеспечивает быстрое вегетативное размножение не только травянистых, но и древесных растений, также прибегая при этом к культуре побегов (например, для декоративных, лесных, плодовых и других деревьев) или каллусным культурам (гвинейская масличная пальма, цитрусовые и др.). Здесь важное значение имеет состояние ювенильности (от англ, juvenile — юношеский, юный), которое обычно растягивается на несколько лет и характеризуется сравнительной легкостью вегетативного размножения.

Для древесных растений известно также явление реювенильности, когда некоторые ткани взрослого растения проявляют свойства проростков, например, формируют придаточные корни. Реювенилизированные ткани все больше используются на практике для размножения отдельных покрытосеменных (например, эвкалиптов) и голосеменных деревьев (разные виды сосны). Ускорение реювенилизации может происходить под влиянием отдельных фенольных соединений (флороглюцин, кверцетин, рутин), памятуя о том, что изменение уровня эндогенных фенольных соединений является составной частью регуляторных процессов, индуцируемых цитокининами.

Каллусные культуры древесных растений также перспективны как и каллусные культуры травянистых растений. Показателен пример с гвинейской масличной пальмой (Elaeis guineensis) — источником получения масла для населения Юго-Восточной Азии, Америки, Африки. К тому же эта пальма не размножается вегетативно. Генетикоселекционная работа по выведению более урожайных сортов на основании полового размножения занимает 15— 20 лет. Вот почему получение каллусов, а затем — эмбриоидов и регенерантов масличной пальмы оказалось экономически выгодным делом. Обычно за 3 месяца удается выращивать из эмбриоидов побеги длиной 12 см (см. рисунок).

Процесс клонирования гвинейской масличной пальмы: 1 — верхушечные молодые листья (посевной материал), 2—5 — сменяемые питательные среды, в которых развиваются каллусы, эволюционирующие в эмбриоиды (4) и затем — в молодые растеньица (5), 6 — образование корней при очередном переносе растения на свежую питательную среду, из которой их пересаживают в грунт.

Учитывая тот факт, что в 1 см3 каллусной культуры содержится до 1 млн, клеток, каждая из которых способна трансформироваться в новое растение, становятся понятными все преимущества метода стерильного вегетативного размножения растений в лабораторных условиях на средах с фитогормонами при последующей пересадке их в почву. Отбирая нужные клетки, можно вывести новые сорта растений, удовлетворяющие запросы по одному или ряду показателей (устойчивость к микробным заболеваниям, урожайность, особая окраска цветов, повышенная продуктивность вторичных метаболитов и т. д.).

Для развития и формирования каллусных культур значительна роль не только фитогормонов, но и так называемыхэлиситоров (от англ, elect — выбирать) — БАБ, дерепрессирующих гены, и, как следствие, активирующих клеточные деления, сравнительно быструю дедиффереицировку специализированных клеток, сопровождающуюся активацией белкового синтеза. Полагают, что элиситорами являются углеводные молекулы, происходящие из гидролизованных гликанов клеточных стенок. Не исключена возможность экзогенного происхождения элиситоров, например, от микроорганизмов.

В случае выращивания клеток растений в глубинных (погруженных) условиях необходимо иметь такие их линии, которые о т в е ч а л и б ы с л е д у ю щ и м т р е б о в а н и я м : с к л о н н о с т ь к р а з м н о ж е н и ю в д е з а г р е г и р о в а н н о м с о с т о я н и и, м о р ф о л о г и ч е с к а я в ы р а в н е н н о с т ь и с о х р а н н о с т ь п у т е й м е т а б о л и з м а. Такие клеточные линии уподобляются одноклеточным микроорганизмам и могут называться "суспензионными культурами" в случае их выращивания в жидких питательных средах. Состав и реологические характеристики сред являются основными факторами, определяющими нахождение одиночных или аггломерирующихся (агрегирующихся) клеток во взвешенном состоянии. Если число клеток в аггломератах превышает 50, то они могут выпасть (или выпадают) в осадок. Желательно, чтобы в процессе размножения клетки дольше оставались в разобщенном состоянии, тогда поддержание суспензионной культуры в течение необходимого времени оказывается вполне достижимым.

Что касается морфологической "выравненности" клеток, то при этом имеют в виду их округлую (или сферическую) форму, уплотненную цитоплазму, сравнительно небольшие размеры (в среднем, от 10 до 50 мкм) и отсутствие трахеидоподобных элементов. Одиночные растительные клетки в таких случаях напоминают одноклеточные эукариотические микроорганизмы; их ростовые характеристики (фазы размножения) в некотором приближении также оказываются совпадающими (lag-фаза, log-фаза, const-фаза, let-фаза), хотя временные интервалы между фазами более растянуты для клеток растений.

Скорость размножения растительных клеток невелика — время удвоения их числа равно 1-—3 суткам и поэтому по данному показателю они существенно уступают, например, бактериальным и дрожжевым клеткам, время удвоения которых в глубинных условиях укладывается для большинства видов в 20—30 минут. Однако, переводя культуру растительных клеток на хемостатное" (непрерывное) выращивание, можно добиться их высокой продуктивности по биомассе или по вторичным метаболитам (пример с Nicotiana tabacum).

Исходные клеточные суспензии обычно получают из рыхлых, оводненных каллусных тканей (2—3 г на 60—мл питательной среды), подвергнутых обработке пектиназой и полигалактуроназой, и помещаемых в жидкую питательную среду, лишенную ионов кальция, но содержащую ауксин — 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту. Условия выращивания поддерживают либо в периодическом, либо в непрерывном режиме, специально подобранном для конкретного биообъекта. В других случаях источниками суспензионных культур могут быть протопласты с реконструированными клеточными стенками.

.Стимулировать деления отдельных клеток изолированных протопластов можно с помощью обогащенных питательных сред или использованием гомологичной ткани — "няньки" ("кормящий слой"), находящейся в состоянии активного роста (рисунок). Колонии из отдельных клеток (клоны) могут быть субкулътивированы один или более раз (при необходимости), а затем переведены в суспензионные культуры.

Рис. Использование ткани-"няньки" (суспензионная культура) при выращивании колоний из одиночных клеток кукурузы или протопластов (схема): 1 —качалочная колба, 2 — колония, возникшая из отдельной клетки, 3 — фильтровальная бумага, 4 — металлическая сетка, 5 — суспензия клеток "кормящего слоя", б — подложка (пенополиуретан), 7 — питательная среда.

Важно также сохранить присущие клеткам метаболические пути при их выращивании в суспензионных культурах. Более того, регулируя обмен, можно добиваться заметного повышения выхода целевых продуктов. При этом всегда необходимо учитывать тип дифференцировки, или состояния специализации исходных клеток, так как от него зависит видоспецифичность первичного и вторичного метаболизма.

Суспензионные культуры обычно выращивают в подходящих емкостях роллерного типа после фильтрации первичной суспензии через стерильные металлические, нейлоновые или марлевые сита для освобождения от крупных аггломератов клеток.

К сожалению, выращивание растительных клеток в "погруженных" условиях пока удается в редких случаях, что обусловлено недостаточной глубиной познания всех особенностей обмена веществ у различных видов и их клеточных культур; определенные помехи здесь связаны и с медленным ростом клеток в строго асептических условиях, их чувствительностью к механическим повреждениям и другими причинами.

В начале 80-х годов в компании Mitsui-Petrocheniical Industries осуществлен первый крупномасштабный процесс по выращиванию растения воробейника (Lithospermum erythrorhizon) в погруженных условиях в целях получения вторичного метаболита — шиконина, являющегося ценным фармацевтическим препаратом и красителем (рисунок). За один периодический процесс удается получать порядка 5 кг коночного продукта, накапливающегося в клетках. На первой стадии клетки воробейника выращивают на среде (с подачей стерильного воздуха) в 200-литровом биореакторе в течение 9 суток; затем культуру переносят в биореактор меньшего размера со средой М-9, стимулирующей продукцию шиконина, и, наконец, в третьем реакторе на 750 л ферментацию ведут в течение 2 недель. Клетки на первой стадии белые, на последней — красные (накоплен шиконин).

Стоимость красителя в 1983г. составляла 4000 долларов за килограмм.

Схема культивирования воробейника в целях получения шиконина (— биореактор, 2 — подача стерильного воздуха, 3 —мешалка, 4 — питательная среда, 5 — выпуск отработанного воздуха, 6 — перенос среды в малый реактор, 7 — фильтрат, 8 — красные клетки, содержащие шиконин).

Не стоит забывать также, что растения — как многоклеточные организмы с огромной емкостью геномов, с половым путем размножения и многоступенчатыми программами развития — являются более сложными объектами для генноинженерных экспериментов, чем, например, вирусы, бактерии и дрожжи. Тем не менее, уже теперь достигнуты определенные успехи с растительными объектами и по прогнозам ученых США к 2010 году ожидается прирост урожайности сельскохозяйственных культур примерно на 60-70% по сравнению с началом 80-х годов текущего столетия в основном на основе использования методов генетической инженерии, когда стал возможным перенос отдельных генов от одного растения другому (в противоположность естественному половому процессу, при котором происходит замена целых блоков сцепленных генов).

Теперь расскажем как сделать генно-инженерные растения. В генноинженерном эксперименте необходимо изолировать конкретный ген, включить его в наследственный аппарат растительной клетки и регенерировать фертильное растение (способное к размножению) с измененным наследственным признаком. В народнохозяйственном аспекте важными признаками являются: высокая урожайность (или продуктивность), скороспелость, устойчивость к различного рода заболеваниям, засухе, к гербицидам и пестицидам, неполегаемость и др. К сожалению каждый из названных признаков контролируется, как правило, группой генов, что заметно усложняет проблему клонирования соответствующих генов.

Однако, природа с давних пор "доказывает" нам, что генетическая инженерия также подвластна и ей. Примером тому служит инфекционная злокачественная болезнь (корончатые галлы) многих двудольных растений, вызываемая почвенной агробактсрией — Agrobacterium tumefaciens.Ta-кие однодольные растения, как пшеница, кукуруза, овес, рис, рожь, сахарный тростник, естественно устойчивы к заражению агробактериями.

В 1971 г. Р. Гамильтон и М. Фолл (США) пришли к выводу о том, что опухоль у растений индуцируется нуклеиновой кислотой. В 1974 г. Н. Ван Ларобеке, П. Энглер и др. (Бельгия) установили, что способность A.turnefacions вызывать образование корончатого галла с большими по размерам плазмидами (в длину 50—80 мкм в разомкнутом состоянии и с ММ 112—156 МДа — мегадальтон), названными Ti- п л а з м и д а м и (от англ, tumor inducing — вызывающий опухоль). Обычно они в клетке содержатся в —2 копиях и составляют примерно 4% ДНК от бактериального генома.

Однажды наведенный Ti-плазмидой опухолевый рост у растения не нуждается в ее дальнейшем присутствии для поддержания злокачественной пролиферации.

Следовательно, выращивание и поддержание опухолевых клеток возможно в стерильной культуре (без агробактерий и без Ti-плазмиды), и, как установлено, без ауксинов и цитокининов, то есть без фитогормонов. При этом они образуют опины, отсутствующие у растений в нормальных условиях, и по которым можно определять опухолевую клетку. В зависимости от клеток корончатого галла могут образовываться агропин, нопалин или октопин. Поэтому и говорят соответственно: клетки агропинового, нопалинового или октопинового типа.

Фактическая ненужность Ti-плазмиды после индукции опухоли у растения связана с тем, что стерильные опухолевые клетки в своих хромосомах содержат ковалентно связанную часть этой плазмиды (около 10%), получившей название Т-ДНК (от англ, transferred — перенесенный), а применительно к клеткам A.tumefaciens с Ti-плазмидой — Т-участок бактерии. Т-ДНК содержится исключительно в ядре клеток корончатого галла.

Таким образом, на примере Ti-плазмиды виден перенос генов от прокариот к эукариотическим растениям в природных условиях (рисунок). Транскрипты интегрированной Т-ДНК в виде мРНК поступают из ядра в цитоплазму клетки, где включаются в реакции синтеза специфических белков на полирибосомах: ядерная ДНК-Т-ДНК -транскрипты -мРНК -полирибосома (трансляция) - белки — синтез опинов (гормоннезависимый рост).

Схема переноса Т-ДНК из агробактерии в растение с последующим формированием корончатого галла (\ — бактериальная хромосома, 2 — Т-ДНК, 3 — Ti-плазмида, 4 — ядро растительной клетки, 5 — встроенная Т-ДНК, б —' корончатый галл); Б. Т-ДНК в Ti-плазмиде октопинового типа (продукты генов 1 и 2 ингибируют транскрипты побеги, гена 3 — ингибируют корни).

Каждый транскрипт определяется специфическим промоторным участком на Ti-плазмиде, узнаваемым полимеразой II растения — хозяина. Из рисунка видно, что функция генов 1—3 проявляется в неорганизованном росте клеток, поскольку тормозится формирование побегов и корней.

Фитопатогенные агробактерии способны вызывать 3 вида раковых опухолей у растений: корончатый галл, бородатый корень и стеблевой галл. Возбудителем каждого заболевания являются A.tumefaciens, A.rhizogenes и A.rubi соответственно, Проникая в поврежденное растение, патогенный микроорганизм с помощью Ti-плазмиды создает свою экологическую нишу и реализует "генетическую колонизацию" объекта — происходит гормон-независимый рост опухолевых клеток.

Ti-плазмиды оказались хорошими векторными системами для осуществления генноинженериых экспериментов с растениями, поскольку Т-ДНК этих плазмид обладает достаточно высокой эффективной емкостью (порядка 50 полинуклеотидов чужеродной ДНК могут быть перенесены и встроены с ее помощью в хромосомную ДНК растений), широким спектром хозяев, инфекционностью и стабильностью.

Перенос гипотетического гена с помощью Ti-плазмиды представлен на рисунке ниже.

Рис. Перенос гена (а) из хромосомы (6) Escherichia coli в растение (5) с помощью Т-ДНК (в) Ti-плазмиды (г) A.tumefacienS (2,3) в ядерную ДНК (д) растительной клетки (4).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.