WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |
ФИТОБИОТЕХНОЛОГИЯ и ЕЁ ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ О.В. Мосин Фитобиотехнология — составная часть биотехнологии, объектами которой являются клетки и ткани растений — фотоавтотрофных эукариот, а также биоактивные молекулы растительного происхождения (ферменты, нуклеиновые кислоты, стероиды и некоторые другие сложные органические вещества).

Название фитобиотехнология слагается из четырех слов греческого происхождения: phyton — растение, bios — жизнь, teken — искусство, logos — наука, слово.

Следовательно, это наука об использовании растительных объектов в технике и промышленном производстве.

На первый взгляд выращивание растений (злаковых, лекарственных, декоративных и т. д.) в полевых условиях подпадает под рубрику "фитобиотехнология", однако, как и с животными, здесь отсутствуют специфические методы промышленного культивирования цельных растений в биореакторах. Таким образом, к фитобиотехнологическим процессам относят те из них, которые базируются на клеточном уровне, если даже клетки несут генетическую информацию, воспринятую ими в результате генно-инженерного эксперимента.

Клетки и ткани высших растений, выращиваемые на питательных средах in vifro в строго контролируемых условиях, все шире используют в фитобиотехнологии.

Общирное царство растений — потенциально неограниченный источник клеток и тканей, которые могут быть введены в культуру и, как следствие, существуют неограниченные возможности для создания новых фитобиотехнологических процессов, в которых нуждается человечество.

В настоящее время царство растений на земном шаре включает порядка 300 000 видов. От рационального и бережного отношения к растениям зависит благополучное выживание человечества на планете Земля.

Представители царства растений (Plantae) Надцарство — Eucaryota Царство — Plantae Отделы: 1. Водоросли — Algae Типы: а) Красные — Rhodophyta б) Золотистые — Chrysophyta в) Желтозеленые — Xanthophyta г) Диатомовые — Bacillariophyta д) Динофлагелляты и криптомонады — Dinophyta е) Бурые — Phaoephyta ж) Зеленые — Chlorophyta з) Эвгленовые—Euglenophyta Некоторые биологи выделяют дополнительный (девятый) тип пиррофитовых водорослей — Pyrrophyta.

Печеночники и мхи — Bryophyta Папоротники, плауны и хвощи — Pteridophyta Семенные растения — Spermatophyta Типы: а) Голосеменные — Gymnospermае б) Покрытосеменные (цветковые) — Angiospermae.

В таком смысле фитобиотехнология является "палочкой-выручалочкой", способной освободить отдельные регионы и страны от импорта и интродукции растений, им не свойственных или совсем неспособных культивироваться в неподходящих климатических зонах. Это тем более резонно, когда речь идет о растениях — продуцентах биологически-активных соединений.

Хотя растительные клетки и ткани принадлежат к более дифференцированным организмам в сравнении, например, с бактериями, тем не менее они способны культивироваться в форме неорганизованной клеточной массы -каллуса. Каллусную ткань можно "заставить" формировать зародышеподобные структуры, почки, побеги, а на их основе — растения-регенераты. Все это происходит благодаря тотипотентности растительных клеток (от лат. totus — все, целый, potentia — сила, потенция). Понятие "тотипотентность" является клеточной характеристикой; в нем отражен потенциал клетки воспроизводить все типы клеток, присущих взрослому организму. Другими словами клетка обладает способностью воспроизводить целый организм.

Если в качестве биообъекта применяют изолированный зародыш, меристему верхушечных или пазушных почек, то есть интегрированную систему, то все получаемые растения-регенеранты будут полностью соответствовать исходному растению, из которого была взята какая-либо интегрированная система из числа вышеназванных. Этим добиваются клонирования интересующих настоящих растений (см. схему ниже).

В случаях применения изолированных клеток и протопластов удается получать измененные варианты исходной формы, которые передают полученные новые признаки потомству.

Этим добиваются возможностей искусственного создания новых форм растений, пригодных для выборки, или селекции (см. рис).

В течение последних лет биотехнологам удалось массовое размножение культивируемых растений с уникальными характеристиками, а выращивание растительных клеток стало основой для получения многих природных веществ, образуемых различными растениями в качестве продуктов вторичного обмена (гликозиды, алкалоиды и другие вещества).

Таким образом, клеточная и молекулярная биология растений составляет основу фитобиотохнологии, а главными направлениями стали создание новых форм полезных растений для сельского и лесного хозяйства, а также разработка промышленного производства химических веществ из растений.

В сравнении с микробной биотехнологией фитобиотехнология является совсем молодой научной дисциплиной, становление которой на промышленные рельсы происходит в настоящее время.

Рассмотрим ниже некоторые методы фитобиотехнологии, первый из которых наиболее важный -вегетативное размножение растений методом культур тканей. Метод культур тканей, или микроразмножение in vitro исключительно удобен для быстрого размножения и сохранения здоровых растений. Для этого производят отбор соответствующих эксплантов, подвергают стерилизации с последующим переносом на подходящую питательную среду. Качество эксплантов зависит от вида и фазы развития растения; органа, из которого взят эксплант; сезона года.

Установлено, что меристемные ткани, сердцевина луковиц, клубнелуковиц и корневищ, надежно защищенные листьями и чешуйками, являются стерильными. Перед удалением покрывающих структур их каждый раз протирают 70% этанолом. Открытые органы — источники эксплантов подвергают стерилизации ртуть- или хлор содержащими агентами.

Самая длительная стерилизация по времени не превышает 40 минут, в других случаях время заметно меньше. В усредненном варианте и применительно к различным культурам растительных тканей, наряду с этанолом (70-95%), рекомендуют еще серебра нитрат (1%), бензалконий хлорид (0,—0,1%) с длительностью экспозиции 0,1—5; 5—30 и 5—минут соответственно.

Экспланты (за исключением материала из надземных частей растений) целесообразно промывать в растворах неионогенных ПАВ перед обработкой дезинфектантом.

После этого ткань тщательно промывают водопроводной водой в течение 10—30 минут, а затем погружают в раствор дезинфектанта и нерезко взбалтывают в течение отведенного времени. После стерилизации растительный биообъект трижды промывают свежими порциями стерильной дистиллированной воды.

Стерилизующий эффект можно повысить следующими процедурами: проведением стерилизации под вакуумом для удаления пузырьков воздуха; помещением материала в 70% этанол до того, как обработать раствором другого дезинфектанта; использованием таких увлажняющих агентов как ТЕИН 80 или твин 20 в виде добавок к растворам дезинфектантов для снижения поверхностного натяжения и обеспечения более полного контакта дезинфектанта с материалом.

В последние годы все чаще применяют специальные емкости для изоляции в асептических условиях органов из молодых растений. Фирма Sigma (США) к 1990 г. ввела новые мембранные наборы для культур растительных тканей. Их изготавливают из микропористой полипропиленовой мембраны, обработанной специальным ПАВ для улучшения прохождения питательных веществ. Мембранные наборы могут быть использованы при культивировании протопластов, в соматическом эмбриогенезе, при получении культур цветов и в других направлениях.

С применением мембран существенно ускоряется рост в сравнении с агаризованной средой, лучше удается освобождать культуры от ингибирующего влияния фенольных веществ, выделяющихся в среду, а также предохранять клеточную линию от существенных повреждений при изучении метаболитов, продуцируемых культурами, и др. Таким путем удается уменьшить расход материалов и, как следствие, снизить цены, поскольку культуры могут поддерживаться в течение длительного времени без замены кулътуральных контейнеров. Ингредиенты (продукты) для культивирования растительных тканей должны производиться в соответствии с требованиями GMP. Этим гарантируется их высокое качество.

Пригодность ингредиентов сред, обеспечивающих рост тканевых культур, оценивают, как минимум, на трех клеточных линиях в 1—3-х пассажах. Избранные основные среды дополняют углеводами, витаминами, регуляторами роста (в зависимости от используемой клеточной линии).

Питательные среды стерилизуют обычно в автоклавах. В принципе желательна стерилизация автоклавированием небольших объемов питательных сред, поскольку многие ингредиенты разрушаются при более продолжительном нагревании и давлении. Установлено, что температура выше 12 0С может быть причиной нарушения качества сред, и, как следствие, плохого роста культур.

Некоторые ингредиенты в растворенном виде стерилизуют фильтрованием (через фильтры с порами 0,мкм в диаметре) и в виде стерильных растворов вносят в приготовленные среды перед их использованием. Питательные среды по своему составу достаточно разнообразны, однако в какой-то мере они и однообразны. В частности, их компоненты можно подразделить на 3 группы: источники органического углерода (чаще — сахароза), неорганические соли (включая источники азота) и стимуляторы роста. К числу последних относятся некоторые витамины комплекса В и растительные гормоны — цитокинины и ауксины. Почти универсальной средой для клеток различных видов является среда MS Т. Мурасиге и Ф. Скуга. Тем не менее, при работе с разными растительными объектами необходим специальный подбор ингредиентов сред для достижения поставленных целей. Питательные среды могут быть плотными за счет внесения 0,7—1% агар-агара и жидкими. Показано, например, что для микрокультуры ананасов предпочтительнее жидкие среды.

Микроразмножение in vitro можно осуществлять из существующих в растении тканей меристемного типа (зародыш, верхушка основного побега) или позже образующиеся пазушные побеги, равно как и из дополнительных меристематических тканей (точки роста, эмбриоиды) изолированных органов растений, где они формируются непосредственно в родительской ткани; из промежуточного каллуса или клеток суспензионных культур.

Если в качестве источника углерода используют в питательных средах сахарозу, то фотосинтез не нужен культуре, однако для морфогенеза и биосинтеза хлорофилла применяют люминесцентные лампы с интенсивностью освещения 1000—5000 люкс.

Важную роль играют регуляторы роста растений — ауксины и цитокины (растительные гормоны, или фитогормоны).

Первые усиливают или поддерживают рост каллусов и корнеобразование in vitro; вторые стимулируют образование почек. Их используют в малых концентрациях, добавляя в стерильном виде к готовым питательным средам.

Ауксинами являются: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, р-хлорфеноксиуксусная кислота, индол-3-уксусная кислота, индрл-3-ацетил-Ь-аланин, индол-3-ацетил-аспарагиновая кислота, индол-3-ацетил-L-фенилаланин, индол-3-ацетилглицин, индол-3-масляная кислота и ее калиевая соль, анафталинуксусная кислота. Среди цитокининов известны:

аденин, 6-бензиламинопурин, 1-бензил-9-(2тетрагидропиранил)-аденин, 6-у-у-диметилаллиламинопурин, 1,3-дифенилмочевина, кинетин, зеатин и некоторые другие.

Смешанными функциями обладают абсцизовая, коричная и гибберелловая кислоты, флороглюцинол; 2,2-диметилгидразид янтарной кислоты.

В целях предотвращения возможного бактериального и грибного загрязнения к ним добавляют такие антибиотики, как полиены (амфотерицин В, нистатин), карбенициллин, цефалоспорин и его производные, левомицетин, аминогликозиды (гентамицин сульфат, канамицин моносульфат), рифампицин и др. Большинство антибиотиков неустойчиво при нагревании, поэтому их растворы стерилизуют фильтрацией через мембраны.

Для растений характерно так называемое апикальное доминирование, при котором за счет регулирующего действия фитогор-монов верхушечная почка развивается быстрее, чем пазушные почки. Если культивировать кончик побега без фитогормонов, то развивается одиночный проросток со строго апикальным доминированием. Если же в среду внести цитокинин и засеять пазушные побеги, то они вырастают недоразвитыми, но с появлением пучка ростков, состоящего из второго, третьего и более порядков, которые можно разделить на составляющие и вновь выращивать на свежей среде до получения пучков таких побегов. Этот процесс можно вести до бесконечности, получая быстро или относительно быстро размножающиеся побеги желаемых растений.

Б большинстве случаев верхушечные (длиной 1—5 мм) и пазушные побеги заражены растительными вирусами, поэтому прибегают к использованию так называемой культуры верхушечных меристематических тканей, когда отрезают лишь 0,3—0,5 мм верхушки, содержащей меристему и 1—листовых примордия с последующей выдержкой при 30— 40°С в течение 1,5—3 месяцев. Этот метод удачно использован и используется для оздоровления хозяйственно ценных растений.

С помощью метода культур тканей удалось значительно повысить коэффициент размножения многих садовых древесных (яблони) и травянистых декоративных растений (ирис, нарцисс, петуния, фиалка и др.), пользуясь придаточными побегами, а также каллусами, индуцированными фитогормонами и дающими побеги или эмбриоиды.

Доступными для производства стали клетки барбариса — продуцента спазмолитика ятроризина, табака — продуцента убихинона-10.

Некоторые каллусы стабильно продуцируют растения — регенеранты в течение 10 лет (табак, хризантемы и др.), оставаясь при этом смесью нерегулярно дифференцированных клеток, среди которых постоянно содержатся диплоидные меристематические клетки, дающие стеблевые апексы или зародыши.

Перед высадкой проростков в грунт прибегают к стимуляции корнеобразования с помощью индолилмаслян.ой кислоты (-0,5—10 мг/л) Фитобиотехнологи, занимающиеся микроклональным размножением растений, должны быть хорошо подготовленными в области биологии растений, с которыми приходится иметь дело, а также в области микробиологической техники работы. Лишь благодаря заинтересованности и профессиональному подходу к выполнению задания обеспечивается высокое качество конечного продукта (материала). Тем не менее необходимо помнить о трудностях, возникающих при микрокультивировании. К ним относятся:

инфицирование растительных тканей вирусами и фитопатогеннымй бактериями (например, Erwinia carotowora), бактериальные и грибковые контаминации, ингибирование тканей фенольными и другими, например, летучими, соединениями, возрастание числа мутаций, и пр.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.