WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

# Термином КЖ обозначены культуральные жидкости, полученные после отделения клеток из ростовых сред Также нами была изучена адаптация этих бактерий к тяжёлой воде на предмет получения клеточных БАС. Было обнаружено, что способность к адаптации к тяжёлой воде у разных родов и видов бактерий различная и может варьировать в пределах даже одной таксономической группы метилотрофных бактерий. Адаптация к тяжёлой воде определяется как таксономической специфичностью микрооорганизмов, так и особенностями их метаболизма, функционированием различных путей ассимиляции субстратов, а также эволюционной нисшей, которую занимает исследуемый объект.

Полученные данные подтверждают устойчивое представление о том, что адаптация к тяжёлой воде является фенотипическим явлением, поскольку адаптированные к тяжелой воде клетки возвращаются к нормальному росту и биосинтезу в протонированных средах после некоторого лаг-периода. По-видимому, клетка реализует лабильные адаптивные механизмы, которые способствуют функциональной реорганизации работы жизненноважных систем в тяжёлой воде. Так, например, нормальному биосинтезу и функционированию в тяжёлой воде таких биологически активных соединений, как нуклеиновые кислоты и белки способствует поддержание их структуры посредством формирования водородных (дейтериевых) связей в молекулах. Связи, сформированные атомами дейтерия различаются по прочности и энергии от аналогичных водородных связей. Различия в нуклеарной массе атома водорода и дейтерия косвенно могут служить причиной различий в синтезах нуклеиновых кислот, которые могут приводить в свою очередь к структурным различиям и, следовательно, к функциональным изменениям в клетке.

Ферментативные функции и структура синтезируемых белков также изменяются при росте клеток на тяжёлой воде, что может отразиться на процессах метаболизма и деления клетки. После обратного изотопного (1Н-2H)-обмена ферменты не прекращают своей функции, но изменения в результате изотопного замещения за счет первичного и вторичного изотопных эффектов, а также действие тяжёлой воды как растворителя (большая структурированность и вязкость по сравнению с обычной водой) приводили к изменению скоростей и специфичности ферментативных реакций в тяжёлой воде.

Структурно-динамические свойства клеточной мембраны, которые в большинстве зависят от качественного и количественного состава липидов, также изменяются в присутствии тяжёлой воды. Полученный результат объясняется тем, что клеточная мембрана является одной из первых органелл клетки, которая испытывает воздействие тяжёлой воды, и тем самым компенсирует реалогические параметры мембраны (вязкость, текучесть, структурированность) изменением количественного состава липидов.

В общих чертах, при попадании клетки в дейтерированную среду из неё не только исчезает протонированная вода за счет реакции обмена вода-тяжёлая вода, но и происходит очень быстрый изотопный (1Н-2H)-обмен в гидроксильных, карбоксильных, сульфгидрильных и аминогруппах всех органических соединений, включая нуклеиновые кислоты, липиды, белки и сахара. Известно, что в этих условиях только С-Н связь не подвергается изотопному обмену и вследствие этого только соединения со связями типа С-2H могут синтезироваться de novo.

Кроме вышеобозначенных эффектов, возможное изменение соотношения основных метаболитов в процессе адаптации к тяжелой воде также может негативно сказываться на рост клетки. Возможно, что эффекты, наблюдаемые при адаптации к тяжёлой воде связаны с образованием в тяжёлой воде конформаций молекул с иными структурнодинамическими свойствами, чем конформаций, образованных с участием водорода, и поэтому имеющих другую активность и биологические свойства. Так, по теории абсолютных скоростей разрыв С1H-связей может происходить быстрее, чем С2H-связей, подвижность иона 2H+ меньше, чем подвижность 1Н+, константа ионизации тяжёлой воды несколько меньше константы ионизации обычной воды.

Суммируя полученные данные, можно заключить, что чувствительности различных клеточных систем к тяжёлой воде отличны. С точки зрения физиологии, наиболее чувствительными к замене 1Н+ на 2H+ могут оказаться аппарат биосинтеза макромолекул и дыхательная цепь, т. е., именно те клеточные системы, которые используют высокую подвижность протонов и высокую скорость разрыва водородных связей. В настоящее время исследования по изучению биотехнологического потенциала метилотрофных бактерий для направленного синтеза изотопномеченых аминокислот и других БАС ведутся на кафедре биотехнологии МГАТХТ им. М.В. Ломоносова и в ГНИИ Генетики и селекции промышленных штаммов микроорганизмов в группе д.б.н. Д. А. Складнева.

Генно-инженерные методы включения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот и белков.

Осуществлять направленное биосинтетическое включение атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот и белков удобно за счёт использования специальных сконструированных генетически векторов экспрессии нужных генов, ответственных за биосинтез того или иного интересующего исследователей белка. Оправдано и целесообразно использование для этих целей векторов экспрессии на основе плазмидной ДНК бактерии E. coli, например, вектор экспрессии Т4 лизоцима. Метод также может применяться для получения индивидуальных меченых белков, экспрессия которых происходит в системах, отличных от E. coli, например, системы экспрессии на основе клеток насекомых или млекопитающих.

Другие микробные системы, в которых белки экспрессируются с высокими выходами, также могут быть пригодны для включения атомов стабильных изотопов в молекулы. К ним относятся такие хорошо изученные биологические объекты, как дрожжи, бактерии и бактериофаги. Так, за счёт использования вышеперечисленных микробных объектов в качестве векторов экспрессии были получены препаративные количества индивидуальных очищенных [15N]белков: нуклеаза стафилококка, интерлейкин, тиредоксин E. coli, гемоглобин, a-протеаза, ингибитор субтилизина, репрессор фага лямбда и др.

Ведущим научным сотрудником ГосНии ГЕНЕТИКА Д. А. Складневым разработан метод включения атомов дейтерия в молекулы индивидуальных белков на основе вектора экспрессии на основе штамма облигатных метилотрофных бактерий Methylobacillus flagellatum [14]. Метод состоит в том, что в метилотрофах клонируют структурный ген исследуемого белка. Таким методом можно в будущем получать, например, [2H]интерфероны, хорошо экспрессируемые в клетках метилотрофов, либо другие интересующие исследователей белки. Метод также позволяет вводить в молекулы аминокислот и белков другие атомы стабильных изотопов, например, изотоп углерода 13C.

Основным недостатком при использовании полученных данным методом [13C]аминокислот в ЯМР-исследованиях являются недостаточно высокие уровни изотопного обогащения аминокислот, что обусловливает усложнение спектров ЯМР за счет 12C- 13C-спин-спинового взаимодействия между близлежащими атомами углерода в молекуле. Так как мультиквантовые резонансы близлежащих атомов углерода в молекуле являются основным препятствием для интерпретации спектров ЯМР, необходимо применять усовершенствованные методы включения атома изотопа углерода 13C в молекулы аминокислот, позволяющие лимитировать процесс разбавления изотопной метки. Так, в последнее время были генетически сконструированы новые штаммы бактерий, которые несут мутации по генам метаболизма определенного круга предшественников этих аминокислот. Это позволяет избежать разбавления изотопной метки при росте микроорганизма на среде, содержащей те или иные меченые субстраты за счет ингибирования биосинтеза аминокислот de novo у данных мутантных штаммов бактерий.

Выделение изотопно-меченых молекул аминокислот из белковых гидролизатов биомассы микроорганизмов.

Биомасса микроорганизмов, выращенных на средах, содержащих стабильные изотопы, является ценным источником различных изотопно-меченых БАС, в том числе аминокислот. Но для того чтобы выделить эти соединения из биомассы необходимо проводить её гидролитическое разложение (гидролиз) с использованием ферментативных или химических методов и последующей ионообменной хроматографией на катионо- и анионообменных смолах (дауэкс, амберлит, пермутит, аминекс, дуолит и др.).

Большое значение при проведении гидролиза белка имеет выбор того или иного гидролизирующего агента, который определяется целью исследования. Ферментативное расщепление протеолитическими ферментами может протекать ступенчато с концов молекулы (экзопептидазами) или путём расщепления специфических отдельных пептидных связей полипептидной цепи (эндопептидазами), причём специфичность зависит от конфигурации, аминокислотной последовательности и конформации белка.

Для селективного химического расщепления белков разработано очень много методов, среди которых имеется несколько методов расщепления по a-углеродному атому молекулы аминокислоты (например, через остатки дегидроаланина).

Щёлочи и кислоты обладают высокой гидролизующей способностью и поэтому их использование приводит к разрушению некоторых аминокислот и к изотопному обмену в триптофане, тирозине и гистидине и в некоторых других аминокислотах. В условиях щелочного гидролиза (4 н. Ba(OH)2 или NaOH, 24 ч, 110 оС ) реакций изотопного обмена водорода на дейтерий практически не наблюдается (исключением является протон (дейтерон) у атома С2 гистидина). Существенным недостатком щелочного гидролиза, лимитирующим его использование, является значительная рацемизация аминокислот.

Поэтому на практике щелочной гидролиз используется крайне редко, а вот кислотный - очень широко.

Кислотный гидролиз в стандартных условиях (6 н. НCl или 8 н. Н2SO4, 24 ч, 110 оС ) приводит к полному разрушению триптофана и частичному разрушению серина, треонина и некоторых других аминокислот. Добавление в реакционную среду фенола, тиогликолевой кислоты, меркаптоэтанола, позволяет сохранить до 80-85% триптофана в гидролизате. Кроме этого, в условиях кислотного гидролиза с высокой скоростью протекает изотопный обмен ароматических протонов (дейтеронов) в молекулах триптофана, тирозина и гистидина, а также протонов (дейтеронов) при атоме Саспарагиновой и С4 глутаминовой кислот. Поэтому для получения реальных данных о биосинтетическом включении дейтерия в белок рекомендуется проводить кислотный гидролиз в присутствии дейтерированных реагентов. Этим способом могут быть выделены и анализированы с использованием ионообменной хроматографии большинство молекул аминокислот в составе гидролизатов белка.

Метод выделения молекул аминокислот из гидролизатов биомассы, будучи широко применяем на практике часто требует использования вредных буферных растворов (ацетат, формиат, пиридин и др.), нескольких колонок с последующей рехроматографией для полного выделения чистых аминокислот из гидролизатов биомассы.

Большой практический интерес представляет реализация преимуществ препаративной обращенно-фазовой высокоэфективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) при разделении оптически чистых изотопно-меченых молекул аминокислот и их Nпроизводных в количествах, необходимых для биоаналитических и синтетических целей.

Научным сотрудником МГАТХТ им. М.В. Ломоносова Егоровой Т. А. разработан метод препаративного разделения индивидуальных молекул аминокислот из различных микробиологических источников с помощью ОФ ВЭЖХ в виде бензилоксикарбонильных производных (N-Cbz производных) аминокислот [15]. Этот метод позволяет выделять аминокислоты с высоким выходом (от 67% до 89%) и хроматографической чистотой (96-99%) и может быть использован для выделения [2H]-, [13C]-, [15N] и [18O]аминокислот из белковых гидролизатов различных источников.

ХИМИКО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ МЕТОД ВКЛЮЧЕНИЯ АТОМОВ СТАБИЛЬНЫХ ИЗОТОПОВ В МОЛЕКУЛЫ.

Другим альтернативным подходом по включения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот является химико-ферментативный метод, основанный на комбинации синтетических и ферментативных реакций. Для этого перспективно и экономически оправдано использование препаратов очищенных ферментов и их экстрактов, безклеточных ферментативных систем, а также иммобилизованных ферментов.

Ферментативные реакции осуществляют на иммобилизованных на твёрдом носителе ферментах, таких как аланиндегидрогеназе (КФ 1.4.1.1) в присутствии NADH при получении [2H]аланина, иммобилизованной на сахарозе фенилаланинаммонийлиазе (КФ 4.3.1.5) и фенилаланингидроксилазе (КФ 1.14.16.1), при получении [2H]фенилаланина и [2H]тирозина, триптофансинтазе (КФ 4.2.1.20), при получении [2H]триптофана, глутаматдегидрогеназе (КФ 1.4.1.2), при получении [2H]глутаминовой кислоты, аспартазы (КФ 4.3.1.1), при получении [2Н]аспарагиновой кислоты и серингидроксиметилазе (КФ 2.5.1.6) при получении [2H]серина.

Осуществление различных методов включения атомов изотопа азота 15N в молекулы аминокислот связано с использованием методов газовой подпитки 15NН3, иммобилизацией клеток с последующей активацией носителя 15N-меченным сульфатом аммония, или с оптимизацией концентраций [15N]предшественников аминокислот в ростовых средах.

Для включения атомов изотопа углерода 13С в молекулы аминокислот могут применяться аналогичные ферментативные подходы с применением [13С]глюкозы, однако при проведении ферментативной реакции требуются значительные количества высокообогащённой [13С]глюкозы и поэтому данный метод является слишком дорогим для получения [13С]аминокислот. Кроме того, большая часть глюкозы (до 70%) идёт на обеспечение процесса дыхания клетки, поэтому эффективность мечения молекул БАС изотопом углерода за счёт ферментативного окисления [13С]глюкозы невысокая.

Перспективны также подходы с использованием комбинации химико-ферментативных и биотехнологических способов включения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.