WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Адаптация клетки к тяжёлой воде является комплексным феноменом и может привести к изменениям активностей ферментативных реакций, что сказывается косвенно на структуре и функциях молекул синтезируемых БАС, процессах биосинтеза и метаболизма и даже морфологии клетки. В связи с этим, разработка методов адаптации клетки к тяжёлой воде для получения высокообогащённых дейтерием молекул является актуальной задачей. При адаптации биологических объектов к тяжёлой воде учитываются химические изотопные эффекты, обусловленные различием в атомной массе, которые для изотопных пар протий/дейтерий могут быть аномально высокими. Различают первичные и вторичные изотопные эффекты. К первичным изотопным эффектам следует отнести изменение констант скоростей химических реакций, протекающих в тяжёлой воде по отношению к таковым в обычной воде, измеренных как соотношение kh /k2h. Это соотношение меняется для различных связей, образованных с участием дейтерия и может варьировать в пределах от 7 до 10 единиц. К вторичным изотопным эффектам относятся изменения в констатнах скоростей химических реакций, обусловленных действием 2Н2О как растворителя (большая струрированность и вязкость, плотность, коэффициент диффузии и т. п.).

Кроме того, тяжёлая вода является соединением, активно поглощающем пары влаги из воздуха, неорганических солей среды, при стерилизации и т. п., и поэтому все этапы, связанные с выращиванием бактерий на тяжёловодородных средах необходимо проводить в герметических условиях с использованием безводных реагентов, предварительно перекристаллизованных в тяжёлой воде неорганических солей и т. п.

Атомы изотопа кислорода 18O можно включать в молекулы аминокислот за счёт выращивания микроорганизмов на средах, содержащих другой изотопный аналог воды - Н218O воду. Адаптация клеток к Н218O в данном случае не является лимитирующим этапом как в случае с тяжёлой водой. Однако, Н218O используется в качестве источника изотопной метки в редких случаях, вследствие высокой стоимости изотопных соединений кислорода.

Использование ауксотрофных мутантов бактерий для включения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот и белков.

Использование ауксотрофных (т.е. требующих для своего роста дополнительных аминокислот) по определённым аминокислотам форм микроорганизмов для включения атомов стабильных изотопов в молекулы стало настолько популярным в биотехнологии, что сегодня его следует рассматривать как отдельное направление. Селективность включения атомов стабильных изотопов в молекулы достигается в результате добавления в ростовую среду меченого аналога соответствующей аминокислоты или её предшественника, по которым штамм ауксотрофен и которые непосредственно или через биосинтетический цикл предшественников de novo заменяют в белке нативную аминокислоту. При этом ауксотрофные штаммы могут относиться к различным таксономическим группам микроорганизмов, включая метаногенные и метилотрофные бактерии, биотехнологический потенциал которых для получения изотопно-меченых аминокислот в настоящее время общепризнан.

Метаногенные (образующие метан) бактерии, относящиеся к группе облигатных анаэробов, которые получают энергию за счет ассимиляции газовой смеси водород/диоксид углерода (H2 -CO2), чаще всего используют для включения изотопа углерода 13C. Эффективность мечения аминокислот изотопом углерода 13C достигается за счёт использования ацетатзависимых мутантов метаногенных бактерий, неспособных синтезировать ацетил-СоА из СО2 и поэтому для их роста необходим экзогенный ацетат.

Выращивание этих бактерий проводят на ростовых средах, содержащих наряду с (H-CO2) добавки ацетата, которые могут заменяться их [13С]аналогами. При росте этих метанотрофов на средах с (H2 - 13CO2 диоксид углерода) и [13C]ацетатом удаётся достичь униформного характера включения изотопа углерода 13C по углеродным скелетам в молекулах аминокислот, а также резкого уменьшения уровня включения экзогенного CO2 в конечный продукт ассимиляции углерода - метан. При этом удается почти полностью избежать разбавления метки в молекулах синтезируемых [13C]аминокислот.

Селективного включения атомов углерода 13C в молекулы аминокислот можно достичь за счёт использования ростовых сред, содержащих немеченую смесь (Н2 -СО2) и [13C]ацетат либо 13CО2 в составе смеси (Н2-13CО2) и немеченый ацетат. Вследствие высокой стоимости CO2 диоксида углерода и неудобств, связанных с его компрессией, включение атомов углерода 13C в молекулы чаще всего осуществляют по первому варианту, т. е. с использованием смеси (Н2-СО2) и [13C]ацетата. Но ассимилирующим [13C]ацетат метанотрофам требуются значительные концентрации ацетата для оптимального роста.

Вследствие этого основным недостатком использования этих бактерий является значительный расход изотопной метки.

При биотехнологическом включении атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот необходимо учитывать пути их биосинтеза в клетке, которые для метаногенных бактерий хотя и являются характеристичными, но несколько отличаются от известных для E. coli. Ниже приведены результаты американского исследователя Патела [3] по биосинтезу [13C]аминокислот, полученных при выращивании ауксотрофной по ацетату бактерии M. hungatei в среде, содержащей в качестве источников углерода и энергии (H2-CO2) и [1,2- 13C]ацетат.

[13C]Аланин. Включение атома изотопа углерода 13C в молекулу аланина происходит за счет реакции карбоксилирования ацетил-СоА до пирувата. Такой путь биосинтеза был продемонстрирован для других таксономических родов и видов метаногенных бактерий.

[13C]Серин и [13C]глицин. Характер распределения атомов изотопа углерода 13C в молекулах серина и глицина объясняется частичным фосфорилированинем пирувата до фосфопирувата и образованием 3-фосфоенолпирувата по гликогенному пути ассимиляции углерода. Подтверждением этому служат значительные уровни активности ферментов- фосфоенолпируватсинтетазы, енолазы и 2-фосфоглицератмутазы, которые были обнаружены в клеточных экстрактах других метаногенов.

[13C]Аспарагиновая кислота, [13C]треонин и [13C]метионин. Включение атома изотопа углерода 13C по атому углерода a-карбоксильной группы аспартата, происходящего из C1ацетата и по b-углеродному атому С2-ацетата и включение атома изотопа углерода 13C в карбоксильные группы аминокислот из диоксида углерода, свидетельствует о том, что биосинтез аспартата в этой бактерии происходил через цикл трикарбоновых кислот в результате ферментативного карбоксилирования пирувата до оксалоацетата.

Распределение атомов изотопа углерода 13C в молекулах треонина и метионина происходит в соответствии с путем биосинтеза этих аминокислот из аспартата. Атом углерода в метильной группе молекулы метионина происходил из диоксида углерода.

[13C]Лизин. Распределение атома изотопа углерода 13C в молекуле лизина свидетельствует о том, что лизин синтезировался из пирувата и аспартата по типичному для бактерий диаминопимелиновому пути.

[13C]Глутаминовая кислота, [13C]аргинин и [13C]пролин. В молекуле глутаминовой кислоты атомы изотопа углерода детектировались в Сb и Cy положениях углеродного скелета молекулы. Атомы углерода при карбоксильной СООН- группе молекулы глутаминовой кислоты и в a-положении происходили из диоксида углерода. Этот результат свидетельствовал о том, что цикл трикарбоновых кислот приводил к образованию a-кетоглутарата. Распределение атомов изотопа углерода 13C в молекулах аргинина и пролина аналогично таковому в глутаминовой кислоте.

[13C]Лейцин, [13C]валин и [13C]изолейцин. Характер изотопного включения углерода 13C в молекулы лейцина и валина свидетельствовал об их образовании из a-ацетолактата, в то время как биосинтез изолейцина отличался от ожидаемого пути биосинтеза этой аминокислоты из треонина. В клетках M. hungatei изолейцин образовывался из ацетата.

Аналогичный путь биосинтеза изолейцина был обнаружен у спирохеты, у лейцинассимилирующего мутанта Serratia marcescens, и у мутанта Saccharomyces cerevisiae, у которого дефектен ген треониндезаминазы.

[13C]Фенилаланин и [13C]тирозин. Меченые позиции атома углерода в молекулах фенилаланина и тирозина полностью совпадали с типичным для бактерий путем биосинтеза этих аминокислот из шикимовой и хоризмовой кислот.

[13C]Гистидин. Атом углерода в положении Cy имидазольного кольца гистидина происходил из диоксида углерода. Углеродный атом в положении Сe имидазольного кольца гистидина был замещён на изотоп углерода 13C с участием С2- ацетата.

Другими перспективными источниками изотопно-меченых аминокислот и белков признаны метилотрофные микроорганизмы, способные ассимилировать метанол и C1углеродные соединения по рибулозофосфатному и сериновому циклам ассимиляции углерода. Метилотрофы представленны в таксономическом аспекте грамположительными, грамотрицательными бактериями и дрожжами, интерес к которым в настоящее время все возрастает благодаря разработке новых технологий химического синтеза метанола. Эти бактерии привлекают внимание исследователей прежде всего как дешевые источники микробного белка и аминокислот. Знание путей бактериального метаболизма позволяет осуществлять направленное введение атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот.

Метилотрофные бактерии окисляют метанол с использованием фермента - метанолдегидрогеназы, последующие окислительные реакции катализируют формальдегид- и формиатдегидрогеназа. Лишь затем продукт окисления метанола в виде формальдегида фиксируется клеткой одним из двух путей ассимиляции углерода:

рибулозо-5-монофосфатным и сериновым (табл.1).

Табл. Параметры роста некоторых используемых в биотехнологии штаммов метилотрофных бактерий Штаммы Молярный Удельная Эффективность Количество бактерий выход скорость роста, конверсии потребленного биомассы, ч-1 углерода азота, % г/моль метанола метанола, % Рибулозо-5-монофосфатный путь ассимиляции углерода Pseudomonas C1 17,3 0,49 67,5 13,Pseudomonas 17,0 0,63 66,5 11,methanolica Methylomonas 15,7 0,52 62,0 11,methanolica Сериновый путь ассимиляции углерода Pseudomonas 1 12,1 0,176 47,5 11,Pseudomonas 135 12,1 0,14 47,5 11,Pseudomonas 9,8 0,093 37,6 11,AMPseudomonas M27 13,1 0,108 51,0 9,Pseudomonas 13,1 0,15 51,0 10,roseus Мы начали эффективно использовать ауксотрофные штаммы метилотрофных бактерий для получения изотопно-меченых молекул аминокислот и белков в группе академика РАМН В.И. Швеца на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова. Для этих целей мы использовали биологическую конверсию дешёвых низкомолекулярных меченых субстратов - (13C)метанола, (2Н)метанола и тяжёлой воды 2H2O в клетках метилотрофов в молекулы дорогостоящих меченых БАС [4-13]. Традиционным подходом при этом было выращивание соответствующих штаммов-продуцентов аминокислот, устойчивых к росту на средах, содержащих стабильные изотопы водорода, углерода, азота и др.

Наши исследования совместно с ведущим нвучным сотрудником Госцентра ГЕНЕТИКА Д. А. Складневым показали, что [13C]метанол в отличие от тяжёлой воды не оказывает существенного биостатического эффекта на ростовые и биосинтетические характеристики метилотрофов. Данный подход эффективно можно эффективно использовать для введения в молекулы синтезируемых БАС двойной изотопной метки (например, введение изотопа углерода 13C в молекулы на фоне максимальных концентраций тяжёлой воды в ростовых средах). Нами были получены [2H]- и [13C]аминокислоты с разными уровнями изотопной обогащённости при росте ауксотрофного по L-лейцину штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum и ауксотрофного по L-изолейцину штамма облигатных метилотрофных бактерий Methylobacillus flagellatum. Эти микроорганизмы выращивались на минимальных средах с (13C)метанолом, (2Н)метанолом и тяжёлой водой 2H2O с последующим выделением [13C]- и [2Н]аминокислот из культуральных жидкостей, так из гидролизатов белков биомассы.

Биосинтетически полученные молекулы [2H]- и [13С]аминокислот представляли собой смеси, в которых присутствовали изотопно-замещённые формы молекул, различающиеся количеством атомов водорода и углерода, замещённых на дейтерий 2H и изотоп углерода C. При этом распределение зависело как от общего включения изотопа в молекулу, так и от способа их получения. Наши исследования показали, что в условиях ауксотрофности по лейцину уровень изотопного обогащения молекулы лейцина, а также метаболически связанных с ним молекул аминокислот немного ниже, чем для других молекул аминокислот, вероятно, за счёт сохранения минорных путей метаболизма, связанных с биосинтезом данных аминокислот de novo. При выращивании B. methylicum на среде, содержащей 98% тяжёлую воду 2H2O и немеченый L-лейцин, уровни включения дейтерия в молекулы индивидуальных аминокислот культуральной жидкости составил 51% для молекулы лейцина/изолейцина, 58,8% для молекулы валина, в то время как уровни изотопного включения для молекулы аланина составили 77,5%, а для молекулы фенилаланина -75% (табл. 2).

Аналогичная корреляция наблюдается и в молекулах аминокислот белковых гидролизатов. Уровни включения атомов дейтерия 2H и углерода 13C в молекулы метаболически связанных аминокислот в пределах одинаковых концентраций меченых субстратов, обнаружили определённую коррелляцию: уровни изотопного включения для молекул валина и лейцина (семейство пирувата), фенилаланина и тирозина (семейство ароматических аминокислот) коррелировали. Уровни изотопного включения для молекул глицина и серина (семейство серина), аспарагиновой кислоты и лизина (семейство аспарагина) также имели близкие величины. Важным результатом являются высокие уровни включения атомов стабильных изотопов 2Н и 13C в молекулы полученных аминокислот.

Табл. Суммарные уровни включения стабильных изотопов в молекулы секретируемых аминокислот и аминокислотные остатки суммарных белков биомассы B. methylicum* и M. flagellatum**.

Аминокислоты Концентрация 2Н2О в ростовой среде, об% 1 %13СН3ОН 24,5 49,0 73,5 98,КЖ# белок КЖ белок КЖ белок КЖ белок КЖ белок Глицин - 15,0 - 35,0 - 50,0 - 90,0 60,0 90,Aланин 24,0 20,0 37,5 45,0 62,5 62,5 77,5 97,5 35,0 95,Валин 20,0 15,0 46,3 36,3 43,8 50,0 58,8 50,0 50,0 50,Лейцин/изолейцин 15,0 10,0 47,0 42,0 46,0 45,0 51,0 49,0 38,0 49,фенилаланин 15,0 24,5 27,5 37,5 51,2 50,0 75,0 95,0 95,0 80,Tирозин - 20,0 - 25,6 - 68,8 - 92,8 - 53,Серин - 15,0 - 36,7 - 47,6 - 86,6 - 73,Aспарагиновая - 20,0 - 36,7 - 60,0 - 66,6 - 33,кислота Глутаминовая - 20,0 - 40,0 - 53,4 - 70,0 - 40,кислота Лизин - 10,0 - 35,3 - 40,0 - 58,9 - 54,*Данные по включению дейтерия в молекулы аминокислот приведены для B. methylicum при росте на средах, содержащих 2% CH3OH и 24,5; 49,0; 73,5; 98,0% Н2О **Данные по включению 13С приведены для M. flagellatum при росте на среде, содержащей обычную воду и 1% 13СН3ОН.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.