WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ, МЕЧЕННЫЕ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ О. В. МОСИН Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В.

Ломоносова, 117571, г. Москва, проспект Вернадского, д.86 ВВЕДЕНИЕ Метод включения атомов стабильных изотопов (дейтерия 2Н, углерода 13С, азота 15N, и кислорода 18О) в молекулы является важным современным направлением в биохимических и структурно-функциональных исследованиях разнообразных природных соединений, включая аминокислоты и белки. Молекулы изотопно-меченых биологически активных соединений (БАС), полученные данным методом являются удобными инструментами для разнопрофильных метаболических и биохимических исследований, медицинской диагностики различных заболеваний, а также химических синтезов разнообразных изотопно-меченых соединений на их основе.

Тенденции к предпочтительному применению стабильных изотопов по сравнению с их радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле методами высокого разрешения: спектроскопией ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной- и лазерной спектроскопией, масс-спектрометрией. Развитие методов детекции стабильных изотопов за последние годы позволило повысить эффективность проведения многочисленных биологических исследований de novo, а также изучать структуру и механизм действия многих клеточных БАС на молекулярном уровне. Селективное введение атомов в молекулы может приводить к включению лишь одного отдельно выбранного атома по определённой позиции углеродного скелета молекулы. Это имеет большой интерес для нанотехнологии, когда в полученной молекуле фигурирует лишь один или несколько атомов, замещённых на стабильные изотопы по определённым положениям молекулы.

Разные методы, используемые для введения стабильных изотопов в молекулы БАС, обычно приводят к получению продуктов, представляющих собой смеси молекул, различающихся количеством атомов, замещённых на стабильные изотопы. Поэтому необходимо разрабатывать и применять новые подходы по получению изотопно-меченых соединений с использованием генно-инженерных методов, комбинации биотехнологических и химико-ферментативных подходов и т. п.

В зависимости от цели исследования при реализации того или иного подхода по получению изотопно-меченых аминокислот и белков должны учитываться их стоимость, выходы, возможности более полного выделения и очистки, а также изотопная чистота синтезированных молекул.

При получении изотопно-меченых молекул аминокислот и белков основные затраты связаны с закупкой сырья (субстрата), расходом электроэнергии (на перемешивание, аэрацию и процессы массопереноса) и охлаждением (теплообменом). При использовании природных сырьевых источников (пептонов, белково-витаминных концентратов и т. п.) в качестве субстратов для производства изотопно-меченых соединений необходимо также учитывать расход электроэнергии, пара и топлива на предварительную глубокую обработку сырья, чтобы превратить его в поддающиеся микробиологическому воздействию соединения. Сравнительная оценка различных способов производства изотопно-меченых аминокислот и белков показывает, что основные расходы связаны со стоимостью сырья, составляющей 70-80% всех затрат.

Использование молекул аминокислот и белков, меченных стабильными изотопами, в значительной мере определяется ограниченной доступностью и дороговизной самих высокоочищенных изотопов, выделяемых из различных природных источников.

Природная распространенность стабильных изотопов варьирует от 0,015% (относительно общего количества элемента) для дейтерия 2Н, до 1,11% для изотопа углерода 13С, однако, несмотря на низкое содержание изотопов в пробах, разработанные в последние годы высокие методы обогащения стабильных изотопов позволяют получать молекулы изотопно-меченых субстратов с высокой степени изотопной чистоты.

ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ВКЛЮЧЕНИЯ АТОМОВ СТАБИЛЬНЫХ ИЗОТОПОВ В МОЛЕКУЛЫ Химический синтез Синтетические методы включения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот представляют собой модифицированный классический синтез аминокислот, в котором стадии карбоксилирования, аминирования, восстановления, гидрирования или гидролиза проводят с использованием меченых реагентов, содержащих вместо обычных атомов стабильные изотопы дейтерия, углерода 13С, азота 15N, и кислорода 18O. Для синтезов [2Н]-, [15N]- и [18О]аминокислот используются такие реагенты, как тяжёлая вода 2Н2О, дейтероводород 2H2, дейтерохлористоводороднная кислота 2НCl; LiAl2H4; B22H6 ; 15NH3 ;

Na15NH2 ; 15NH2Cl, 18H2O и др.

Основным недостатком химического синтеза является то, что он приводит к получению молекул [13С]аминокислот, у которых атомы углерода 13С локализуются по карбоксильным СООН-положениям молекул. Это существенно ограничивает использование полученных этим методом [13С]аминокислот для биологических исследований из-за возможной потери изотопной метки углерода 13С за счёт функционирования многочисленных реакций ферментативного декарбоксилирования, происходящих в организме. Разработанные за последние годы синтетические методы введения атома углерода 13С в молекулы аминокислот направлены на решение этой проблемы и затрагивают такие положения углеродных атомов в молекулах аминокислот, как метильная группа метионина, С2 - положение в имидазольном кольце молекулы гистидина, а также атомы углерода при карбоксильных СООН- группах аспарагиновой и глутаминовой кислот.

Любому химику известно, что химический синтез – многостадийная трудоёмкая операция, и требует больших расходов ценных реагентов и меченых субстратов и приводят в результате к продукту, представляющему собой рацемическую смесь D- и L-форм молекул аминокислот, для разделения которых требуются специальные методы. Более тонкие способы включения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот связаны с использованием комбинации химических и ферментативных подходов.

Изотопный (1Н-2Н)- и (16О-18O)-обмен.

При помещении молекулы в тяжёлую воду происходит быстрый изотопный (1Н-2H)обмен атомов водорода на дейтерий в гидроксильных -ОН, карбоксильных -СООН, сульфгидрильных –SH, аминогруппах –NH2 и амидных –NH группах. Реакция изотопного (1Н-2Н)-обмена протекает по механизму электрофильного замещения протонов на дейтерий и затрагивает определённые, наиболее чувствительные к замещению протоны в молекулах. Этим методом могут быть получены в граммовых количествах дейтерированные ароматические аминокислоты - L-[2,3,4,5,6-2Н]фенилаланин в 85% H2SO4 при 500 C, L-[3,5- 2H]тирозин в 6 н. 2H2SO4 при слабом кипячении раствора, L[2,4,5,6,7-2H]триптофан в 75% [2H]трифторуксусной кислоте при температуре 25 0С и L[2-2H]гистидин в 6 н. NaO2H при 80 0С.

Но этот метод ограничен нестабильностью белков в жестких условиях (85-90% НCl/ H2SO4, 80-100 оC), необходимых для проведения реакции изотопного обмена. Кроме того, проведение изотопного обмена в более жёстких условиях сопровождается рацемизацией аминокислот. Избежать этого позволяет непосредственное введение полученных за счёт (1Н-2Н)-обмена дейтерированных аналогов аминокислот - L-[2,3,4,5,6-2Н]фенилаланина, L[3,5-2H]тирозина и L-[2,4,5,6,7-2H]триптофана в молекулы индивидуальных белков например, в мембранный белок бактериородопсин галофильных бактерий Halobacterium halobium, при росте бактерий на средах с этими аминокислотами [1].

Имеются и другие интересные схемы реализации изотопного обмена. Например, разработанный нашим соотечественником Ю. Золотарёвым метод включения атомов дейтерия в молекулы алициклических аминокислот (глицин, аланин, валин, изолейцин, серин, треонин, пролин, гистидин) реакцией высокотемпературного твёрдофазного каталитического изотопного обмена [2]. В соответствии с этим методом L-аминокислота в протонированой форме реагирует с газообразным дейтерием при 200-250 0С в присутствии высокодисперстного катализатора группы платины (Pt, Pd, Rh), и неорганического носителя (BaSO4, CaCO3, Al2O3).

С помощью изотопного обмена можно также включать изотоп кислорода-18 в молекулы аминокислот. Для этого используют аналогичную (1Н-2Н)-обмену реакцию изотопного (16О-18О)-обмена по атомам кислорода карбоксильных СООН- групп в молекулах аминокислот в присутствии Н218 О в качестве источника метки. Использование этого метода на практике лимитируется высокой стоимостью полученных таким способом [18О]аминокислот. Однако, он полностью оправдывает себя при проведении многочисленных биомедицинских исследований с применением синтезированных молекул [18O]аминокислот, так как они, в отличие от их дейтерированных аналогов, стабильны по отношению к обратному изотопному обмену. [18О]аминокислоты стабильно циркулируют в плазме крови в течении нескольких дней после инъекции. Обратный изотопный (18О-18О)-обмен по карбоксильным положениям в молекуле [18О]тирозина и других молекулах [18O]аминокислот проявляется лишь при длительной инкубации клеток крови с питательной средой.

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ВКЛЮЧЕНИЯ АТОМОВ СТАБИЛЬНЫХ ИЗОТОПОВ В МОЛЕКУЛЫ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ Выращивание микроорганизмов на средах со стабильными изотопами.

Биотехнология предлагает альтернативный химическому способ включения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот и белков, который приводит к высоким выходам синтезируемых продуктов, к эффективному включению атомов изотопов в молекулы соединений, и, самое главное, к сохранению природной L-конфигурации (стереоселективности) конечных продуктов. Метод заключается в выращивании штаммов-продуцентов необходимых БАС на ростовых средах, содержащих различные субстраты. Эти субстраты могут быть и органическими соединениями и неорганическими солями, содержащие стабильные изотопы дейтерия 2 Н, углерода 13С, азота 15N и кислорода О.

Решающее значение для биотехнологического введения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот и белков имеет правильный выбор микроорганизмов, способных к устойчивому росту на средах, содержащих стабильные изотопы и к продукции нужных БАС. Наиболее доступными объектами для получения многих изотопно-меченых белков признаны микроводоросли, большое разнообразие которых в природе позволяет выбирать среди них отдельные виды, способные к эндогенному накоплению белков. В то же время комплексное использование компонентов меченой биомассы микроводорослей позволяет выделять, например, дейтерированные аминокислоты из гидролизатов суммарных белков биомассы, выращенной на тяжёловодородной среде.

Другие традиционные штаммы микроорганизмов также могут эффективно применяться для получения изотопно-меченых молекул аминокислот и белков. Основными требованиями к микроорганизмам, используемым для этих целей являются устойчивый рост на средах, содержащих стабильные изотопы и высокий уровень продукции нужных БАС, который можно повысить за счёт применения генно-инженерных методов, а также мутагенеза и селекции. Это создаёт предпосылки для конструирования новых бактериальных штаммов-продуцентов с заданными свойствами. Биотехнологический подход экономически целесообразен и особенно незаменим, когда необходимы высокая стереоселективность и максимальные уровни изотопного обогащения синтезируемых соединений.

При биосинтетическом включении атомов стабильных изотопов в молекулы используют несколько подходов – селективное по определённым положениям молекулы и униформное включение стабильных изотопов по всему углеродному скелету молекул.

Селективного включения атомов стабильных изотопов в определённые положения молекул аминокислот и белков достигается за счёт применения комбинации меченых и немеченых субстратов в ростовых средах, меченых предшественников аминокислот, или при использовании ауксотрофных по определённым аминокислотам штаммов микроорганизмов. Для этих целей очень хорошо подходит такая распространённая бактерия как E. coli, биосинтез аминокислот в которой к настоящему времени изучен наиболее детально и для которой получен многочисленный набор мутантных форм.

Униформное включение стабильных изотопов в молекулу достигается за счёт выращивания микроорганизмов на средах, содержащих меченые субстраты высокого уровня изотопной чистоты и с последующим фракционированием компонентов биомассы на различные классы природных соединений. Так, например, получают дейтерированные аминокислоты и белки выращивая бактерии на средах с 99,9%-ной тяжёлой водой.

Молекулы аминокислот с униформным характером включения атома углерода-13 по скелету молекулы получают, в основном, при выращивании автотрофных микроорганизмов на ростовых средах, содержащих вместо обычных углеродных субстратов их низкомолекулярные [13С]аналоги, например 13СО2. Этим методом на практике были получены многие [13C]белки, синтезируемые микроводорослями:

ферридоксин, цитохром, флаводоксин и др.

Включения атома азота 15N в молекулы аминокислот добиваются аналогичным путём за счёт выращивания микроорганизмов на водных средах, содержащих К15NO3 или другие N-содержащие соли, а высокообогащённые дейтерием аминокислоты можно получать с использованием ростовых сред, содержащих вместо обычной воды 99,9% тяжёлой воды.

Что же касается тяжёлой воды, то существует ряд определённых трудностей при использовании Н2О при выращивании клеток организмов, поскольку необходимо учитывать эффекты, связанные с клеточной адаптацией к ней. Известно, что тяжёлая вода действует токсически на клетки, ингибируя жизненно-важные функции роста и развития многих микроорганизмов. Однако, несмотря на биостатический эффект тяжёлой воды, разные таксономические роды бактерий могут быть достаточно легко адаптированы к росту и биосинтезу на средах содержащих максимальные концентрации тяжелой воды, в то время как клетки высших растений способны выдерживать не более 60% тяжёлой воды, а животные клетки не более 30%.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.