WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |

2.4 Иммунологические методы ИФА-метод выявления антител к H. pylori в сыворотке крови В ответ на инвазию слизистых оболочек H. pylori включается Вклеточное звено иммунитета и синтезируются антигеликобактерные антитела классов IgG и IgA. Характерный для раннего иммунного ответа синтез Ig М не установлен ни в одном исследовании. Это обстоятельство может свидетельствовать о длительном течении геликобактерной инфекции до ее клинических проявлений. IgA вырабатываются как в слизистой оболочке ЖКТ, так и секретируются в слизистые оболочки из плазмы крови. IgG поступают из плазмы, где сохраняются длительное время, по-видимому, в течение всей жизни.

Иммунологические методики основаны на выявлении антител классов IgG, IgA в крови и секреторных sIgA в слюне и желудочном соке. Колонизация H. pylori вызывает системный иммунный ответ. Через 3-4 недели после инфицирования в слизистой оболочке и в крови больных появляются антитела к H.

pylori. Они определяются путем иммуноферментного анализа.

Поскольку инфекция является хронической и спонтанный ее клиренс невозможен, положительные серологические тесты у нелеченных пациентов указывают на наличие текущей инфекции.

Несмотря на то, что уровень антител в процессе успешной эрадикации падает, серологическая реакция остается положительной в течение ряда лет. Этот «серологический рубец» ограничивает возможности исследования крови для оценки эффективности лечения или для диагностики наличия у больного НР. Однако быстрое падение уровня антител косвенно может указывать на санацию СО желудка. Имеется несколько модификаций этого теста: ELISA (ферментный иммуносорбентный метод), реакции фиксации комплемента, бактериальной и пассивной гемагглютинации.

Классический иммуноферментный анализ (ИФА) с количественным определением в сыворотке или плазме крови больных антигеликобактерных антител разных классов характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью.

Данный метод идеален для первичной диагностики, так как при высокой чувствительности и специфичности он на сегодняшний день самый дешевый. Повышение чувствительности и специфичности метода (вследствие совершенствования технологии) позволило применять его для диагностики эрадикации.

Если 5 лет назад диагностика эрадикации с помощью иммуноферментного анализа была возможна только через 8-месяцев после лечения, то для выпускаемых в настоящее время наборов для ИФА этот срок уменьшился до 3 месяцев.

Использование же высокочувствительных наборов для непрямого ИФА с применением антигена H. pylori, меченного биотином (набор для ИФА “HELICONS-AB Ig G” производства фирмы “Consortia Lab”, Италия), позволяет зафиксировать снижение концентрации специфических антител уже через 30-дней после окончания успешного лечения и, таким образом, укладывается в сроки оценки эрадикации, принятые для инвазивных методов и дыхательного теста. Учитывая данное обстоятельство, а также то, что стоимость такого анализа не намного выше стоимости обычного ИФА, следует признать его весьма перспективным.

Данная методика позволяет получить результат сразу в виде значения титра – отношение концентрации специфического антигеликобактерного IgG (в мкг) к содержанию общего IgG в сыворотке крови (в мг), а также предусматривает использование неразведенной сыворотки крови, что существенно ускоряет выполнение анализа.

Кратко протокол исследования состоит в следующем. В лунки, сенсибилизитровнные антителами барана против IgG человека, добавляли 100 мкл неразведенной сыворотки и инкубировали мин при комнатной температуре. Затем после 3-кратной промывки буфером в каждую лунку добавляли 100 мкл комплекса антигена H.

pylori с биотином и вновь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. В эти же лунки, не удаляя предыдущий реагент, добавляли 100 мкл комплекса стрептавидинпероксидаза и инкубировали при температуре 20 минут. Лунки отмывали 5 раз буфером. В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора субстрата (тримеилбензидин и Н2О2) и инкубировали в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре, а потом останавливали реакцию путем добавления в лунки 50 мкл 2н.

раствора HCI. Если через 4 недели после окончания терапии значение титра уменьшалось на 20% или более по сравнению с исходными, то полагают, что в результате лечения наступила эрадикация H. pylori. Если же значение титра повышалось, не изменялось или уменьшение его составляло менее20 %, то это расценивали как отсутствие эрадикации.

ИФА-метод выявления антител к H. pylori в капиллярной крови В последние годы наблюдается исключительно бурное развитие иммунологических методик. Только быстрых тестов для определения в капиллярной крови больных антител к H. pylori производится в мире более 20 видов. В России зарегистрирован тест Fast-Read HP (CQI-Biomed, ЗАО ПРОТЕА), чувствительность и специфичность которого составляют 94% и 98% соответственно (по сравнению с иммуноферментным анализом). Преимуществом таких тестов является быстрота их выполнения (в пределах минут) и отсутствие необходимости в дополнительном оборудовании и персонале. Однако стоимость одного анализа в два раза выше, чем стоимость анализа, выполненного обычным иммуноферментным методом.

Больше всего такие тесты подходят для использования в поликлинических условиях, когда необходимо получить ответ об инфицированности больного непосредственно на амбулаторном приеме, чтобы сразу назначить лечение. Недостатком быстрых тестов является невозможность их использования для контроля за эрадикацией, что связано с технологией, положенной в основу методики.

ИФА-метод выявления антигена H. pylori в кале Несколько лет назад в Европе появился новый неинвазивный тест, на основе ИФА, позволяющий определять антиген H. pylori в кале - Premier Platinum HpSA (Meridian Diagnostics, Италия).

Многочисленные мультицентровые исследования, как в нашей стране, так и за рубежом показали высокую чувствительность и специфичность этого теста при первичной диагностике Н.pyloriинфекции и контроле лечения (A. Markristatis, 1998; D. Vaira, 1999;

В.М. Говорун, 2000). Этот тест был признан "золотым стандартом" в диагностике Н.pylori-инфекции. Более того, полученные данные свидетельствуют, что с помощью этого теста можно мониторировать лечение, то есть прогнозировать эффект антигеликобактерной терапии. Единственным ограничением широкого использования этого теста в клинической практике остается его высокая стоимость по сравнению с другими методами диагностики хеликобактериоза.

2.5 Молекулярно-биологические методы Полимеразная цепная реакция Метод предназначен для качественного обнаружения ДНК H. pylori в биологических образцах (биоптаты антрального отдела желудка, биоптаты двенадцатиперстной кишки, биоптаты десен, мазки из зубодесневого кармана, слюна.). Позволяет оценить генотипические и фенотипические характеристики возбудителя.

Почти у каждого пациента имеется уникальный штамм H. pylori.

Выявлено, что вирулентность H. pylori во многом обусловливает клинические проявления инфекции. Существует ряд генов, продукты которых – белки Cag A, Vac A, Ice A, Bab A – полагают факторами патогенности. В зависимости от их наличия выделяют два типа штаммов НР. Экспрессирующие Cag A- и Vac A-токсин относятся к первому типу, штаммы второго типа не экспрессируют указанные гены и считаются менее патогенными. Среди большого многообразия гибридизационных методов анализа ДНК, метод ПЦР наиболее широко используется в клинической лабораторной диагностике.

Принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Polymerase chain reaction (PCR)) был разработан Кэри Мюллисом (фирма “Cetus”, США) в 1983г. и в настоящее время широко используется как для научных исследований, так и для диагностики в практическом здравоохранении и службе госсанэпиднадзора (генотипирование, диагностика инфекционных заболеваний).

В основе метода ПЦР лежит природный процесс комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК.

Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий:

1) Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК);

2) Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК);

3) Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей) Данный процесс можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителей инфекционных заболеваний.

Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке последовательности ДНК, а только в определеннных стартовых блоках- коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой цепи только в этом участке, а не по всей длине ДНК цепи. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки (20 нуклеотидных пар), называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.

Таким образом, ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК катализируемое ферментом ДНК- полимеразой.

Методика проведения анализа с использованием метода ПЦР включает три этапа:

первый этап: выделение ДНК (РНК) из клинического образца второй этап: амплификация специфических фрагментов ДНК третий этап: детекция продуктов амплификации Выделение ДНК (РНК) На данной стадии проведения анализа клиническая проба подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций, и получение раствора ДНК или РНК, свободной от ингибиторов и готовой для дальнейшей амплификации. Выбор методики выделения ДНК(РНК) в основном определяется характером обрабатываемого клинического материала.

Амплификация специфических фрагментов ДНК На данной стадии происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей детекции. В большинстве методик определения специфических фрагментов генома используется т.н.

“классический вариант направленной ПЦР. Для повышения специфичности и чувствительности анализа в некоторых методиках используется метод “гнездной” (nested) ПЦР, в котором используются 2 пары праймеров (“внешние” - для 1 стадии, и “внутренние” - для 2-ой стадии).

Детекция продуктов амплификации В большинстве методик на данном этапе проводится разделение смеси продуктов амплификации, полученной на 2-ой стадии, методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. До проведения электрофоретического разделения, к амплификационной смеси добавляется раствор бромистого этидия, образущий с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения внедрения. Эти соединения под действием УФоблучения способны флуоресцировать, что регистрируется в виде оранжево-красных светящихся полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в агарозном геле.

В качестве альтернативы электрофоретическому методу детекции, имеющему некоторые недостатки: субъективность чтения результатов, ограничения по определению ДНК различных микроорганизмов в одной реакции, могут быть предложены гибридизационные схемы детекции. В этих схемах образующийся в результате амплификации фрагмент ДНК гибридизуется (образует 2-х цепочечные комплексы - "гибриды") со специфическим олигонуклеотидным зондом. Регистрация таких комплексов может быть проведена колориметрически или флуориметрически. В НПФ "Литех" созданы наборы для детекции на основе гибридизации с флуориметрической регистрацией результатов.

Для получения достаточного количества копий искомого характеристического фрагмента ДНК амплификация включает несколько (20-40) циклов.

Особенности взятия биопсийного материала.

Взятие биопсийного материала проводится во время эндоскопического исследования. Перед началом противохеликобактерной терапии биопсийный образец берется из антрального отдела желудка. При контроле лечения взятие биопсийного образца проводится не ранее чем через 4 недели после проведения противохеликобактерной терапии из тела желудка.

Взятый биопсийный образец опускается в стерильную сухую пробирку (эппендорф) и немедленно доставляется в лабораторию.

Для более длительного хранения возможна заморозка взятого биопсийного материала при температуре -200С.

Особенности взятия биоптатов десен, мазков из зубодесневого кармана и слюны.

Биопсийный материал из десен, мазки из зубодесневого кармана и слюна берутся у пациентов с гастродуоденальной патологией в анамнезе при наличии у них гингивитов и парадонтоза.

Взятый биопсийный образец опускается в стерильную сухую пробирку (эппендорф) и немедленно доставляется в лабораторию.

Для более длительного хранения возможна заморозка взятого биопсийного материала при температуре -200С. Мазки из зубодесневого кармана собираются в стерильную пробирку (эппендорф) с физиологическим раствором. В этом случае пробирки могут храниться в холодильнике (+4- +60С) не более часов, а их транспортировка осуществляется в сумке-холодильнике.

Особенности взятия (сбора) слюны За 12- часов до взятия (сбора) слюны исключается прием пищи, алкоголя и лекарственных препаратов. Непосредственно перед сбором слюны необходимо исключить использование зубной пасты и удалить зубные протезы. Перед тем, как собрать слюну необходимо почистить зубы без зубной пасты, затем хорошо прополоскать рот без использования раздражающих средств. Далее, общую слюну (смешанную) выплевывают изо рта или отсасывают со дна рта одноразовым шприцем и переносят в пробирку (эпендорф). Слюна может храниться в холодильнике (+4- +60С) не более 12 часов, а ее транспортировка осуществляется в сумкехолодильнике.

Существует неинвазивный вариант ПЦР-диагностики геликобактериоза с использованием кала в качестве материала для исследования (Premier Platinum HpSA).

ПЦР в кале Попытки создания альтернативного, более дешевого, неинвазивного метода диагностики Н.pylori-инфекции на основе ПЦР до настоящего времени заканчивались неудачей из-за большого количества ложно-положительных результатов (A.

Markristatis, 1998; D. Vaira, 1999; L Trevisani, 1999). Тем не менее, на базе научной лаборатории НПФ "ЛИТЕХ" был разработан новый тест для диагностики Н.pylori- иннфекции в кале на основе ПЦР.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.